牛乳过敏原β-乳球蛋白制备、中试生产设计及其致敏性的细胞学评估

摘要

食物过敏是食物中某种成分（变应原或过敏原）刺激人体免疫系统产生一种异常的病理性免疫应答。八大类食物过敏原中牛乳过敏较为普遍，而β-乳球蛋白是牛乳主要的过敏原之一，由反刍动物乳腺上皮细胞合成，含量约占乳清蛋白总量的55％，人乳中则不含有。
　　本文采用制备型反相高效液相色谱获得高纯度的牛乳过敏原β-乳球蛋白，对其进行辐照协同超声非热加工处理。通过光谱学方法表征不同加工处理后过敏原的结构特征，在此基础上，利用人外周血嗜碱性粒细胞 KU812，建立体外细胞模型评估蛋白致敏性变化。文章关键的实验方法、现象结果及结论表述如下。
　　1.建立制备型反相高效液相色谱仪（C18）分离纯化牛乳过敏原β-乳球蛋白的方法，小试实验仅用25 min，经SDS-PAGE鉴定，得到的β-乳球蛋白纯度达到98.2%，得率为32.25%。基于小试参数进行十倍放大的中试工艺设计，选取C18色谱柱（直径25 mm，长度250 mm），上样量100 mL，体积10 mg/mL，并完成设备的选型，绘制工艺流程图和设备流程图。
　　2.牛乳过敏原β-乳球蛋白经超声（40KHz，300W，30min）和辐照（5 kGy）协同处理，分为四组：原蛋白组，辐照组；先超声后辐照组，先辐照后超声组。加工后蛋白发生不同程度的聚合，一级和空间结构均发生不同程度的改变。在蛋白聚合过程中，二级结构从无序转为有序状态，Trp19基团向 Arg124运动，荧光强度被部分猝灭，疏水基团包埋，荧光强度降低。并且，加工蛋白三级结构也发生改变，二硫键Cys106-Cys119可能发生断裂，既增强了巯基含量又有利于蛋白聚合。间接竞争ELISA法测定加工β-乳球蛋白与IgG的结合，结果显示结合能力明显降低，蛋白的部分抗原决定簇被破坏，降低了蛋白抗原性。
　　3.选取对数生长期KU812细胞（l.0×l06个/mL）进行体外细胞学评估实验，检测 KU812细胞脱颗粒释放的生物活性介质：β-HEX、组胺、TNF-α、IL-6以及胞内Ca2+浓度变化。结果发现原蛋白组检测到的活性物质含量最高，外钙内流现象最明显。Western Blot法检测KU812细胞激发后信号通路的Lyn、Syk、NF-κB以及 MAPK家族蛋白的表达情况，原蛋白组信号通路上游和下游的磷酸化蛋白含量都最高，而加工蛋白的磷酸化程度较低。上游信号通路的源头激酶Lyn、Syk被抑制可以进一步抑制下游通路蛋白，从而抑制整个信号通路的转导。转录因子NF-κB被抑制导致新合成的细胞因子TNF-α和IL-6含量降低。同时，检测到的信号蛋白证实牛乳过敏可以由IgE/FcεRI信号通路介导，且KU812细胞系适合用于牛乳过敏机制的检测。体外细胞学评估再一次证明辐照技术可以降低蛋白致敏性，由于超声处理温和，其作用效果不明显。

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第1章 引言

1.1 概述

1.2牛乳过敏原β-乳球蛋白的理化性质

1.3 牛乳过敏原β-乳球蛋白分离纯化方法

1.4 牛乳过敏反应的效应细胞和活性物质

1.5 立题背景与研究内容

第二章 牛乳β-乳球蛋白分离纯化小试工艺

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2. 3结果分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 辐照协同超声对牛乳β-乳球蛋白结构及抗原性的变化

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3. 3结果分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 基于人外周血嗜碱性粒细胞 KU812活化模型评估牛乳β-乳球蛋白致敏性的变化

4.1引言

4.2实验材料与方法

4. 3结果分析

4.4讨论

4.5 小结

第五章 牛乳β-乳球蛋白分离纯化中试工艺设计

5.1 引言

5.2 中试实验设计思路

5.3 结果与讨论

5.6 小结

第六章 结论和展望

6.1结论

6.2展望

致谢

参考文献

附录 A

攻读学位期间的研究成果