10 mL体系免疫磁富集单核细胞增生性李斯特菌的研究

摘要

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌。该菌可通过食物、水和动物粪便等传播，在低温（4℃）下仍能生长繁殖，人类被L. monocytogenes感染后的致死率可达30％，在新生儿与免疫力低下人群中感染死亡率更高达70%。快速灵敏地检测食物中污染的L. monocytogenes对保证食品安全具有重要意义。免疫磁分离是提高食源性致病菌检测灵敏度的有效样本前处理方法，目前针对L. monocytogenes磁富集方法的研究大多是基于1 mL体系，本研究基于10 mL体系分别构建了一步法和两步法免疫磁富集李斯特菌的方法，并进一步结合mPCR技术对L. monocytogenes进行了快速，灵敏的检测，实现了L. monocytogenes高倍浓缩与灵敏检测目的。各章内容分述如下：
　　第一章综述了有关L. monocytogenes及免疫磁分离技术的研究进展。
　　第二章研究建立了基于一步法和两步法磁富集L. monocytogenes的方法。一步法中，链霉亲和素偶联于磁珠表面，抗体与生物素结合，构建介导BAS系统的免疫磁珠，实现了10 mL体系中目标菌分离与纯化。该方法各步骤最优的条件分别为：1）每毫克磁珠标记链霉亲和素量80μg，2）生物素化抗体用量为100μg/mg，3）10 mL捕获体系中免疫磁珠的投入量为700μg，4）免疫反应时间为90 min，5）磁分离时间为5 min。在最优条件下，缓冲液中L. monocytogenes浓度低于106 CFU/mL时，磁捕获效率不低于90.9%±6%，且全过程反应时间不超过2 h，表明该方法在PBS溶液中能够缩短预富集时间，同时具有较高的捕获效率。然而在一步法的磁捕获方法中，特异性抗体的用量较大，导致实际使用过程中磁分离成本较高。因此本研究在一步法磁捕获的基础上提出了利用两步法磁富集L. monocytogenes的新方法，即首先在体系中投入生物素化的抗体与L. monocytogenes进行特异性结合，随后再加入链霉亲和素化的磁珠与抗体上的生物素结合，从而实现磁场下L. monocytogenes的富集回收，两步法有效地降低了10 mL体系下抗体使用量。该方法的最优条件分别为：1）磁分离体系中生物素化抗体用量为5μg，2）链霉亲和素化磁珠用量50μg/mL，3）最佳免疫反应时间为60 min，4）磁分离时间为3 min。最优条件下，PBS缓冲液中L. monocytogenes浓度低于105 CFU/mL时的捕获效率高于85.4%±4.8%，抗体用量较一步法降低14倍。
　　第三章建立了基于复合 PCR技术高灵敏联合检测实际样本中 L. monocytogenes及绵羊李斯特菌的新方法。该方法的最优条件为：L. monocytogenes（136 bp）引物浓度为0.75 mM（actA），绵羊李斯特菌（311 bp）引物浓度为0.05 mM（iactA），李斯特属（370 bp）引物浓度为0.08 mM（prs）， IAC（475 bp）引物浓度为0.05 mM（16S rRNA基因），退火温度为52℃，PCR循环次数为35次。在实际样本（生菜）的加标检测实验中，通过结合10 mL体系免疫磁分离，该方法的检测限可达10 CFU/g样本，且总的分析时间不超过7 h。以上结果表明大体积免疫磁分离技术结合复合PCR技术可实现L. monocytogenes及绵羊李斯特菌的快速及高灵敏检测。

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第一章 前言

1.1 单核细胞增生性李斯特菌（L. monocytogenes）的研究进展

1.2 免疫磁分离技术研究进展

1.3 研究的目的及意义

第二章 10 mL免疫磁富集单核细胞增生性李斯特菌方法的建立

2.1 前言

2.2 试剂与材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 小结

第三章 10 mL免疫磁富集在实际样本中检测单核细胞增生性李斯特菌的应用

3.1 前言

3.2 试剂与材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录A1试剂

附录A2仪器设备

个人简介

攻读学位期间的研究成果

获奖情况：