CXC195通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路和激活内质网应激调控人肝癌细胞增殖及凋亡

摘要

目的：研究CXC195在体外诱导HepG2细胞凋亡并抑制细胞增殖。探讨PI3K-AKT-mTOR信号通路和内质网应激共同诱导HepG2细胞凋亡。为CXC195治疗肝癌提供帮助。
　　材料和方法：体外培养HepG2细胞株作为实验组，对照组使用L-02细胞株。化学反应合成CXC195。联合台盼蓝拒染法和MTT比色法检测CXC195分别作用HepG2细胞和L-02细胞后细胞的存活情况，流式细胞术分析细胞凋亡，检测浓度为10μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM的CXC195作用于 HepG2细胞和L-02细胞的平均生长存活率。用Western blotting检测150μM CXC195作用HepG2细胞后， PI3K-AKT-mTOR信号通路PI3K、AKT、mTOR及磷酸化蛋白和内质网应激相关蛋白表达变化。
　　结果：
　　①CXC195抑制HepG2细胞生长：台盼蓝拒染法和MMT比色法检测细胞存活结果显示，加入CXC195后，人肝癌细胞（HepG2）和正常肝细胞（L-02）的生长存活率均明显降低。并且，随着CXC195剂量从10μM逐渐增加到200μM，HepG2细胞存活率从97.3％逐渐降到42.9%，L-02细胞存活率从98.5%逐渐降到65.1%。不同剂量CXC195作用相同细胞生长存活率下降有显著差异，相同剂量CXC195作用于两组细胞比较，存活的肝癌细明显少于正常肝细胞L-02。MMT比色法检测结果表明，用150μMCXC195处理HepG2细胞12、24、48、72小时，细胞存活率也明显依次下降。流式细胞术检测发现，150μM CXC195作用HepG2细胞24小时后，细胞存活于G0/G1期较多（71.62%vs45.17%，P<0.01），S期（17.53%vs41.11，P<0.01）和G2/M期（10.85%vs13.72%，P<0.05）细胞比例明显减少。结果表明：与正常肝细胞（L-02）相比，CXC195能更多抑制肝癌细胞（HepG2）生长，CXC195对肝癌细胞生长的抑制作用与药物浓度和药物作用时间呈正相关。并且CXC195主要作用于S期和G2/M期肝癌细胞HepG2。
　　②CXC195诱导HepG2细胞凋亡：AnnexinV/PI双染色法标记后，通过流式细胞仪检测发现，各浓度CXC195诱导人肝癌细胞（HepG2）凋亡率明显高于正常肝细胞（L-02）。随着CXC195剂量从10μM逐渐增加到150μM， HepG2细胞凋亡率从5.04%逐渐上升到35.21%，而L-02细胞凋亡率从4.03%逐渐上升到19.30%。随着CXC195剂量增加， HepG2细胞凋亡数量明显增多，相同剂量CXC195作用于两组细胞比较， HepG2细胞的凋亡率明显高于对照组L-02细胞。结果表明：CXC195诱导肝癌细胞（HepG2）凋亡作用显著强于正常肝细胞（L-02），且随着药物浓度增加，诱导凋亡作用逐渐增强。
　　③CXC195对HepG2肝癌细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响：采用Western blotting分析，浓度为150μΜ的CXC195作用HepG2细胞，Bcl-2/Bax比值、p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表达量均非常明显少于未加CXC195对照组。联合使用通路上PI3K、AKT、mTOR对应的抑制剂 LY294002，SH-6和雷帕霉素处理5μmol/L后，细胞凋亡率超过50%，同时通路相关蛋白p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表达量较单用150uM CXC195均非常明显减少。结果表明：CXC195通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导通路相关蛋白诱导HepG2细胞凋亡，降低HepG2细胞增殖。
　　④采用Western blotting检测发现，在经过浓度为150μΜCXC195作用后， HepG2细胞中GRP78， GRP94、CHOP、p-PERK， PERK， p-eIF2α， eIF2α、ATF4、IRE1α， p-ASK， ASK， p-p38， p38， p-JNK、JNK、Cleaved ATF6和ATF6表达量明显高于对照组。说明了内质网应激参与了CXC195诱导的HepG2细胞凋亡过程。
　　结论：CXC195能显著抑制HepG2肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，主要针对S期和G2/M期细胞。而对正常肝细胞（L-02）抑制生长和诱导凋亡的作用则明显较弱。CXC195的这一作用可能是通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达和激活内质网应激来实现的。这些研究结果提示CXC195在体外对肝癌细胞有一定治疗效果。