抗内皮素A型受体抗体与系统性硬化症相关肺动脉高压的相关性研究

摘要

背景及目的：
　　系统性硬化症(Systemic sclerosis, SSc)相关肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension, PAH）是导致SSc患者死亡的重要原因之一。因为其起病隐匿，临床表现常不典型，早期诊断困难，治疗效果不理想。目前对于 SSc-PAH早期诊断，治疗，预后评估仍是困扰风湿免疫科医生的重要难题。
　　肺动脉高压(PAH)是 SSc相关的肺部疾病中预后最差的并发症之一，其病理变化与内皮细胞功能障碍及局部炎症有关，在晚期则表现为肺血管平滑肌细胞过度增殖、凋亡减少。在PAH的病理过程中内皮素-1( Endothelin-1, ET-1)起到了非常重要的作用。ET-1是由血管内皮细胞合成的21肽，作为一种强力持久的血管收缩剂，促进血管壁的肥厚和纤维化的发生。ET1正是通过与其受体(Endothelin receptor,ETR)（A型受体、B型受体）结合发挥收缩血管的作用，特别是位于肺动脉平滑肌细胞和血管内皮细胞的内皮素 A型受体(Endothelin Receptor Type A,ETRA)，是触发血管的收缩主要因素，同时在细胞增殖和肺动脉免疫微环境的调控中发挥了重要的作用。本研究拟通过检测抗内皮素 A型受体抗体(Anti-Endothelin Receptor Type A Autoantibodies ETRA-Ab)在SSc-PAH患者血清中的阳性率和特异性，从而探索ETRA-Ab与SSc-PAH发病及疾病严重程度之间的关系。进而探讨抗内皮素A型受体抗体作为协助早期诊断SSc-PAH生物标记物的可能性。并通过动物实验进一步证实 ETRA-Ab作为功能性抗体，在SSc-PAH发病机制中的作用。
　　方法：
　　1、临床观察：共纳入24例SSc-PAH样本。同时选择24例相匹配SSc非PAH对照，24份正常对照。记录临床数据，心彩超测肺动脉收缩压(PASP)。其中5例SSc-PAH行右心导管检测。测定各组6分钟步行距离（6WMD）。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测以上各组血浆中的抗ETAR抗体，计算阳性率。
　　2、建立MCT肺动脉高压大鼠模型：共36只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组（n=12）、MCT组（n=12）、MCT+ETRA-Ab组（n=12）。MCT组和MCT+ETRA-Ab组行腹腔注射野百合碱（Monocrotatine，MCT），MCT+ETRA-Ab组在腹腔注射MCT后第1~3周经尾静脉给予注入多克隆IgG ETRA抗体，每周3次。
　　3、平均肺动脉压力（mPAP）测定：于MCT造模后4周，经右颈外静脉插管，用Medlab-E生物机能信号采集系统测mPAP。并使用SPSS20.0分析各组间的差异。
　　4、右心肥厚指数(RVHI％)测定：取出心脏，分离左右心室和室间隔，分别称量右心室壁（RV）的质量和左心室和室间隔（LV+S）的质量，计算右心肥厚指数=RV/(LV+S)。分析各组间的差异。
　　5、肺血管形态学观察：切取完整右肺上叶，甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、烘干、HE染色。光镜下观察各组大鼠肺小动脉形态学变化。比较各组肺血管肌型动脉（MA）,部分肌型动脉（PMA）,无肌型动脉（NMA）比例的变化。
　　6、检测各组血浆中炎症因子白介素（interleukin IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor TNF）-α的水平，分析各组间差异。
　　结果：
　　1、 SSc-PAH组与SSc非PAH组ETRA抗体阳性率比较前者ETRA抗体阳性率50.0%。后者ETRA抗体阳性率为12.5%，正常对照组ETRA抗体阳性率为0%。阳性率比较有显著性差异（P＜0.01）。
　　2、SSc-PAH患者血清中ETRA抗体滴度水平与肺动脉压力PASP有相关性(r=0.3439 P=0.0321)。而ETRA抗体滴度水平与6分钟步行距离测试结果之间存在显著的负相关(r=-0.3221， P=0.0391)，与 NT-proBNP结果呈现相关性（r=0.3335, P=0.0318）。与末梢循环检测指数呈正相关（r=0.3439，P=0.0321）。
　　3、建立MCT模型第4周，注射10%水合氯醛，腹腔麻醉，经颈外静脉插管，行三组间mPAP（mmHg）比较：正常对照组（17.3±1.1）。MCT组（30.8±2.0）、MCT+ETRA-Ab组（34.5±3.1）（P＜0.05）。
　　4、测压后处死动物右室分离行右心肥厚指数比较：MCT组（0.355±0.051）、MCT+ETRA-Ab组（0.402±0.049）（P＜0.05）。
　　5、肺组织HE染色，比较MA、PMA、NMA在三组中所占比例（PMA、PPMA、PNMA）的变化：MCT+ETRA-Ab组中PMA、PPMA高于MCT对照组（P＜0.05），两者均明显正常对照组。
　　6、血浆炎症因子测定：MCT组、MCT+ETRA-Ab组中IL-6、TNF-α(pg/ml)水平明显高于正常对照组。但MCT+ETRA-Ab组较MCT组升高更加显著（P＜0.05）。
　　结论：
　　1、ETRA-Ab对于SSc-PAH的诊断有较好的敏感性和较高的特异性，从而提示ETRA-Ab可以作为SSc-PAH早期诊断的新型生物标记物。
　　2、SSc-PAH患者中ETRA-Ab滴度与PASP、NT-proBNP正相关，与6分钟步行距离测试距离负相关。提示ETRA-Ab滴度可以作为评估患者病情，判断预后的指标。
　　3、ETRA-Ab对MCT大鼠的血流动力学指标、右心肥厚指数、肺血管形态变化指数升高均有上调作用。并上调血浆中的炎症因子 IL-6、TNF-α。提示ETRA-Ab作为功能性抗体可能参与到了包括肺血管重塑，右心肥厚等多个方面。

目录

声明

中英缩略词表

第1章 前言

第2章 临床观察

2. 1临床资料

2. 2 试剂与仪器

2. 3 方法：

2. 4 统计学处理

第3章 动物实验材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学处理

第4章 结果

4.1 临床试验结果

4.2 动物试验结果

第5章 讨论

第6章 结论

6.1 实验结论

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:系统性硬化相关肺动脉高压血清标记物研究进展