齐墩果酸在肾缺血/再灌注损伤中抗氧化应激、炎症反应及凋亡的保护作用与机制研究

摘要

随着血管吻合及器官保存技术的不断进步，以及吗替麦考酚酯、他克莫司等新型免疫抑制剂的开发和应用，器官移植技术得以不断发展；其中，肾移植开展最早、发展最快、诊疗技术最成熟、目前完成病例数最多，已逐步成为终末期肾脏疾病的主要治疗手段。临床上，因肾移植医疗资源消耗大、供体稀缺、费用高，使得其疗效期望值较高。导致移植肾功能损伤甚至早期移植失败的因素较多，其中肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)是包括感染、心脑血管事件、免疫排斥等在内的重要因素之一。齐墩果酸（oleanolic acid, OA）属于五环三萜类化合物；最近研究表明 OA可参与调节细胞增殖、生长、凋亡等生物过程，对急性脏器损伤具有保护作用；推测其对肾脏 IRI亦具备保护作用。深入研究 IRI的分子机制以及在肾移植中的影响，积极探寻有效的药物及分子治疗靶点，减少及避免 IRI导致的移植肾损伤，对于临床防治和科学理论研究都有重大意义。
　　目的：观察缺血再灌注对肾脏功能的损伤； OA在肾缺血再灌注损伤过程中对肾脏功能丢失、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的影响；揭示 OA减轻缺血再灌注肾损伤的药理作用及分子机制。
　　方法：实验分为两个部分。
　　第一部分：齐墩果酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用
　　1.构建肾缺血/再灌注损伤大鼠模型，在造模前采用不同浓度（12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg）的OA进行大鼠腹腔注射进行预治疗，设立对照组。
　　2.采集大鼠静脉血液标本，采用生化法检测其肌酐、尿素氮浓度。
　　3.收集大鼠血液及肾脏组织，采用 ELISA酶联免疫法等检测人肾损伤分子1(Kim-1)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、INF-γ、IL-6、IL-10及髓过氧化物酶（MPO）的表达，检测细胞凋亡，观察OA对缺血再灌注肾脏功能损伤、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的影响。
　　第二部分：齐墩果酸减轻肾缺血再灌注损伤的作用机制探讨
　　1.构建肾缺血/再灌注损伤大鼠模型，在造模前采用50mg/Kg OA或50 mg/kg OA+ BSO（丁硫酸亚砜胺，为 GSH的抑制剂）进行大鼠腹腔注射进行预治疗，设立对照组。
　　2.采集大鼠静脉血液标本，采用生化法检测其肌酐、尿素氮浓度。
　　3.收集大鼠血液及肾脏组织，采用 ELISA酶联免疫法等检测肾脏损伤因子（KIM‐1、LDH），氧化应激标志物 MDA，炎症因子 IFN‐γ的表达及细胞凋亡率，观察 OA减轻肾缺血再灌注损伤的保护作用及抗细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡是否依赖于GSH功能维持。
　　4.采用Trizol法提取总RNA，运用RT-qPCR技术检测模型大鼠肾脏中Nrf2和 GCLc催化亚基 mRNA的表达，分析 OA或 BSO干预对 Nrf2和 GCLc mRNA表达的影响。
　　结果：
　　第一部分：齐墩果酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用
　　1.采用外科血管夹闭技术阻断肾脏血液灌注成功构建了肾缺血再灌注损伤大鼠模型；在造模15天前给予大鼠进行腹腔 OA或 BSO注射干预，进展顺利。
　　2.肾脏发生缺血再灌注损伤后，大鼠血肌酐/尿素氮升高，LDH、KIM-1表达增加；予以 OA预治疗，大鼠血肌酐/尿素氮、LDH及 KIM-1水平相对下降，并表现为OA剂量依赖。
　　3.肾脏发生缺血再灌注损伤后，大鼠 MDA表达明显增加，而 SOD、CTA、GPx、GSH活性明显下降。予以 OA预治疗，大鼠 MDA表达明显减少，而 SOD、CTA、GPx、GSH活性明显上升，这种效应并和 OA浓度密切相关。
　　4.肾脏发生缺血再灌注损伤后，大鼠 IFN-γ、IL-6及 MPO表达明显增加，而 IL-10表达明显下降。予以OA预处理后，大鼠 IFN-γ、IL-6及 MPO表达明显减少，而IL-10增多。
　　5.肾脏发生缺血再灌注损伤后，大鼠肾脏细胞凋亡增加，凋亡蛋白酶3表达明显增加。予以 OA预处理后，大鼠细胞凋亡数明显减少，凋亡蛋白酶3表达降低，这种效应并表现于OA浓度依赖。
　　第二部分：齐墩果酸减轻肾缺血再灌注损伤的作用机制探讨
　　1.OA+BSO+I/R组大鼠 BUN、Cr、KIM-1、LDH、MDA、IFN-γ的表达水平及细胞凋亡率明显高于OA+I/R组大鼠。
　　2.I/R组大鼠 Nrf2 mRNA相对表达量为0.2170.032，明显低于对照组大鼠（为1.0240.085）。OA+I/R组大鼠 Nrf2 mRNA相对表达量明显高于 I/R组大鼠；OA+I/R组大鼠Nrf2 mRNA相对表达呈OA剂量依赖趋势。
　　3.I/R组大鼠 GCLc mRNA相对表达量为0.1580.014，明显低于对照组大鼠（为1.0890.052）；OA+I/R组大鼠GCLc mRNA相对表达量明显高于I/R组大鼠；OA+I/R组大鼠GCLc mRNA相对表达呈OA剂量依赖趋势。
　　结论：OA预治疗可减轻缺血再灌注肾脏功能损伤、细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡；OA在肾缺血再灌注损伤中的保护作用依赖于 GSH综合体， Nrf2/GCLs可能是其下游信号通路。

目录

声明

中英文缩略语

第1章引言

第一部分齐墩果酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用

1. 材料与方法

1.1主要试剂

1.2动物培养

1.3实验设备

1.4实验分组

1.5实验方法

2 结果

2.1成功构建肾缺血再灌注大鼠模型及OA预处理浓度的选取。

2.2观察OA干预对模型大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用。

2.3 OA预处理减轻肾缺血再灌注损伤与抗氧化应激密切相关。

2.4 OA预处理减轻肾缺血再灌注损伤与抗炎效应密切相关。

2.5 OA预处理减轻肾缺血再灌注损伤与抗细胞凋亡密切相关。

3讨论

第二部分齐墩果酸依赖GSH综合体及Nrf2/GCLc信号通路减轻肾缺血再灌注损伤的作用机制探讨

1．材料与方法

1.1主要试剂

1.2动物培养

1.3实验设备

1.4实验分组

1.5实验方法

2. 结果

2.1 GSH 综合体功能的正常维持与 OA 减轻缺血再灌注肾损伤的保护作用密切相关

2.2 OA预处理对Nrf2和GCLc表达的影响

3讨论

结论与展望

结论：

展望：

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:齐墩果酸在缺血再灌注损伤中的保护作用