冲击流场作用下人脐静脉内皮细胞P120连环蛋白及转录因子Kaiso亚细胞定位的初步研究

摘要

目的：
　　颅内动脉瘤形成的具体机制仍在探索。目前认为血流动力学因素所致的血管内皮细胞损伤及相关炎症反应是颅内动脉瘤形成的始动环节。我们前期研究显示冲击流作用下培养的血管内皮细胞P120连环蛋白（P120-catenin，p120ctn）及转录因子Kaiso的表达均减少。本研究拟通过体外实验观察冲击流作用下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）p120ctn及Kaiso的亚细胞定位的变化，探究p120ctn及Kaiso参与调控血流动力学所致内皮细胞受损的相关机制。
　　方法：
　　体外实验培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及运用shRNA CTNND1重组慢病毒转染的 HUVEC。分别将上述两种细胞种植在涂有纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的普通载玻片上，待细胞90％以上融合后，将载玻片置入冲击流作用下内皮细胞体外培养装置。对照组不加载冲击流，实验组加载流速为500ml/min的冲击流作用于HUVEC3小时和6小时。运用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学检测p120ctn和Kaiso在细胞胞浆及胞核的表达情况。
　　结果：
　　（1）在冲击流作用下培养6小时后，可见冲击点处细胞的形态及细胞间粘附维持正常；其临近区域的细胞密度明显降低，可见细胞变圆，且大部分被冲散；而下游区域的细胞密度增大，部分细胞生长排列与冲击流方向大致相同。
　　（2）蛋白免疫印迹分析显示：对照组HUVEC的胞质及胞核内均表达p120ctn和Kaiso。与对照组相比，随着冲击流作用时间延长，实验组HUVEC内p120ctn在胞质表达下降，在胞核表达增多，具有统计学意义（P＜0.05）；Kaiso在胞质内表达无明显变化（P＞0.05），而在胞核内表达增多（P＜0.05）。运用shRNA CTNND1重组慢病毒转染HUVEC后，与正常HUVEC对比，其p120ctn蛋白表达显著降低，具有统计学意义（P＜0.05）。
　　（3）免疫细胞化学显示：对照组HUVEC内p120ctn主要在胞质内表达；Kaiso主要在胞核周围表达，在胞核内少量表达。与对照组相比，随着冲击流作用时间延长，p120ctn在胞质内表达减少，在胞核内表达明显增多；Kaiso在胞核周围表达减弱，而在胞核中表达有增多的趋势。运用shRNA CTNND1重组慢病毒转染HUVEC后，p120ctn表达明显减弱，且Kaiso在细胞核表达增多的趋势减弱。
　　结论：
　　冲击流作用下，随着加载冲击流时间的延长，HUVEC内p120ctn可能发生质核穿梭，由胞质进入胞核内。敲除p120ctn基因后，冲击流作用下Kaiso在细胞核内的表达减少。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 研究对象及细胞株

2.3 主要试剂

2.4 试验方法

2.5 统计学方法

第3章 结果

3.1 培养的HUVEC形态

3.2 阴性对照病毒和shRNA CTNND1分别转染进HUVEC

3.3 蛋白免疫印迹法检测冲击流作用下脐静脉血管内皮细胞内p120ctn及Kaiso的亚细胞表达情况

3.4 免疫细胞化学法检测冲击流作用下血管内皮细胞p120ctn及Kaiso的亚细胞定位情况

第4章 讨论

4.1 血流动力学参与血管内皮细胞损伤的机制

4.2 p120ctn表达变化及血流动力学作用下参与内皮损伤的可能机制

4.3 Kaiso表达变化及血流动力学作用下参与内皮损伤的可能机制

4.4 p120ctn与Kaiso的相互关系及其参与血流动力学作用下内皮损伤的可能机制

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:P120连环蛋白参与细胞炎症反应的研究进展