阴道菌群移植及阴道益生菌组合对细菌性阴道炎的治疗及其机制研究

摘要

背景和研究目的： 阴道微生态环境的菌群种类改变或数量失衡可引起多种阴道疾病。目前临床上针对细菌性阴道感染疾病的治疗手段主要是采用抗生素治疗，而抗生素治疗可显著改变阴道的微生态环境并造成菌群失调，从而导致治疗效果不佳、复发率高等问题。 大量研究表明，人体的健康状态与肠道菌群密切相关，且肠道益生菌双歧杆菌与乳酸菌在宿主消化、免疫调节以及慢性疾病的预防与治疗方面发挥着重要作用。鉴于阴道环境与肠道环境在生理状态和菌群组成上有很大的相似性，以及艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）与细菌性阴道炎（Bacterial vaginosis，BV）在发病机理与治疗手段上的相似性。我们首次提出阴道菌群移植（Vaginal microbiota transplantation，VMT）的概念。该方法旨在利用正常人体的阴道菌群或将分离出的正常人体阴道益生菌混合物植入实验室构建的大鼠细菌性阴道炎模型，以期恢复与重构失衡的阴道菌群，从根本上保护阴道微生态环境免受环境因素和致病菌的干扰。本课题的研究将为开发治疗阴道炎症的新型微生态制剂奠定基础。 方法： 1.健康女性阴道分泌物中微生物的分离。从健康女性阴道分泌物中，通过菌落形态以及菌体形态对阴道微生物进行初步筛选，然后进行测序确定筛选菌株种属； 2.分离菌株的体外益生性质评价。通过体外实验，评价分离菌株的耐酸、耐胆盐、抗氧化、抑制致病菌生长、细胞粘附、定植抗力等方面的特性； 3.大鼠阴道炎模型的建立。实验分组为阴性对照组（C组）、模型组（M组）、甲硝唑治疗（MA组）、益生菌组合治疗组（MP组）、阴道菌群移植治疗组（MV组），每组5只。将乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌按照1：1：2的比例配制混悬液，对实验大鼠造模。造模期间解剖部分大鼠取子宫组织做HE染色，判断造模是否成功。随后连续治疗7天，恢复一周进行后续实验； 4.菌群移植对大鼠阴道炎模型的治疗评价。恢复期后，解剖，观察各组大鼠子宫整体形态并做 HE以观察子宫病理变化，IHC染色观察Caspase-3、Caspase-8、FasL表达；q-PCR检测子宫组织中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子转录水平；Elisa法检测子宫组织中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子蛋白水平。高通量测序以及q-PCR判断大鼠阴道群菌种类及数量的变化。 结果: （1）从健康女性阴道分泌物中筛选出瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、加氏乳杆菌（L.gasseri）、唾液乳杆菌（L.salivarius），假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）以及表皮葡萄球菌（S.epidermidis）。我们选出瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、唾液乳杆菌五株益生菌用于后续实验。 （2）菌株的益生性质评价结果显示瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌及唾液乳杆菌对酸耐受程度与阴道酸性环境相一致，但多数菌不耐受胆盐压力；对常见的氧化自由基、超氧自由基、亚铁离子、羟基自由基、1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）等具有较好的清除能力，并且具有较好的总还原能力；分离菌株对细菌性阴道炎病原菌白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌等有较好的抑制生长作用；细胞粘附能力结果显示，我们筛选的部分分离菌株对宫颈癌上皮细胞（Hela）细胞具有较好的粘附能力，并且对致病菌的定植具有良好的抵抗效果。 （3）模型治疗评价结果显示，C组的子宫形态结构、颜色以及子宫壁均表现为正常；M组的子宫炎症明显并且子宫壁变薄，正常结构被破坏，出现水肿充血现象；MA组经过治疗后，子宫炎症消失但是个别样本出现变形萎缩情况；MP组以及MV组的子宫形态正常，子宫壁形态结构基本恢复正常。病理生理学HE检测结果与子宫整体形态一致。IHC检测结果显示恢复期后Caspase-3、Caspase-8、FasL表达下调。M组与C组比较，其子宫组织IL-4的mRNA及蛋白水平明显降低，而IL-1β、TNF-α的mRNA及蛋白水平则显著升高。结果显示，MP组及MV组阴道细菌感染均有显著的改善（p<0.05）。高通量测序与q-PCR结果显示，MP组以及MV组与M组相比菌群丰度提高，肠球菌及肠杆菌数量减少，乳酸菌数量明显增加；MA与MV组和MP组相比阴道菌群丰度明显降低（p<0.05）。 结论： （1）阴道菌群移植和阴道益生菌组合对细菌性阴道感染疾病具有明显的治疗效果； （2）阴道菌群移植和阴道益生菌组合通过降低凋亡因子Caspase-3、Caspase-8、FasL的表达，促进抑炎因子IL-4的表达以及降低促炎因子IL-1β、TNF-α的表达而发挥抗炎作用； （3）高通量结果表明，尽管甲硝唑对细菌性阴道炎的治疗具有良好的治疗作用，但其在降低阴道炎症的同时也降低了阴道菌群的多样性。阴道菌群移植和阴道益生菌组合不仅对抑制阴道炎症具有良好效果，而且能够保持或恢复治疗组大鼠阴道菌群的多样性，从而对预防细菌性阴道炎的复发具有重要作用； （4）首次提出阴道炎治疗的阴道菌群移植法，避免了使用抗生素带来的危害，为开发治疗阴道炎的新方法与药物提供了线索与实验依据。

目录

第1章 前言

1.1粪菌移植及其在疾病治疗中的应用

1.2阴道菌群移植及可行性分析

第2章 材料和试剂

2.1 仪器和试剂

2.2实验所用引物

2.3实验材料:

2.4主要试剂的配制

第3章 实验方法

3.1健康女性阴道微生物的分离

3.2 细菌基因组16S rRNA测序

3.3阴道益生微生物的体外评价

3.4动物实验阴道炎模型建立及治疗

3.5动物实验阴道炎模型治疗后各项指标检测

第4章 结果与分析

4.1阴道微生物的筛选

4.2阴道益生微生物体外益生性质评价

4.3 阴道菌群移植及阴道益生菌组合对细菌性阴道炎治疗评价

第5章 讨论

第6章 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间的研究成果

综述: 阴道细菌感染性疾病研究综述