多蛋白质生物界面的构建及其电化学生物传感研究

摘要

多蛋白质生物界面的研究，有助于了解生物系统中酶促反应的机理。探讨生物界面中氧化还原蛋白质（或酶）的电子传输过程，能为了解真实生物体系的电子传输机理提供参考以及发展高灵敏的电化学生物传感器等。多蛋白质生物界面构建的传感器具有选择性高、操作简单、分析速度快和有望进行在线活体检测等优点，在食品检测、环境监测以及探究生命体信息传递规律等方面均有重要应用前景。将具备良好导电性和生物相容性的复合材料以及能很好地保持酶活性的生物分子材料用于固载多蛋白质，以构建有利于电子转移的生物界面。本研究致力于发展新型材料固定化技术，以改善所固定的生物蛋白质分子的活性、提高生物传感器的性能。实验中构筑了一系列多蛋白质生物界面以揭示蛋白质间的相互作用机理和信息传递规律，并发展性能优越的电化学生物传感器。具体的研究工作如下：
　　 ⑴(GOD/Con A)n二蛋白质多层膜界面的构建及其电化学葡萄糖传感器的研究。利用电沉积技术在玻碳电极(GCE)表面制备金纳米粒子-壳聚糖(AuNPs-CHIT)纳米复合材料修饰电极。由于AuNPs-CHIT纳米复合材料具有大的比表面积和良好的生物相容性，有利于刀豆球蛋白A(Con A)固载于修饰电极表面上，再利用Con A与葡萄糖氧化酶(GOD)之间的凝集素-葡糖基生物特异性结合，固载GOD分子，最后重复固载Con A和GOD制备多层膜界面。凝集素-葡糖基生物特异性结合方式能使蛋白质GOD定向吸附在电极表面从而可用于研究酶的直接电子传输。同时采用层层自组装(LBL)技术，可以增大GOD的固载量。实验详细研究了GOD的直接电化学和电催化特性，并测试了检测葡萄糖的性能指标。
　　 ⑵基于GOD-Cyt c共固载于AuNPs-CHIT修饰电极上构建的新型葡萄糖传感器的研究。首先将AuNPs-CHIT电沉积到GCE表面上，再将GOD-Cyt c共固载于AuNPs-CHIT/GCE修饰电极上。AuNPs-CHIT复合材料大的比表面积和良好的生物相容性可增大Cyt c-GOD在电极上的表面覆盖度。此外，Cyt c能为GOD提供一个生物相容的微环境从而很好地保持GOD的生物活性，并且有利于实现GOD的直接电子传输。实验发现在检测葡萄糖时，GOD-Cyt c/AuNPs-CHIT/GCE二蛋白质修饰电极比GOD/AuNPs-CHIT/GCE单蛋白质修饰电极的检测范围更宽、检出限更低，这是因为GOD在O2存在时将葡萄糖催化氧化生成葡萄糖酸和H2O2，同时消耗O2。而Cyt c能将H2O2歧化分解为水和O2，使支持电解质溶液中的O2消耗更慢，从而使检测范围变宽。此研究为构筑性能更加优越的二蛋白质生物界面葡萄糖传感器提供依据。
　　 ⑶基于LBL的（HRP-Cyt c/DNA）n多层膜的电子传输及电催化研究。利用LBL技术在Cyt c单层膜电极上交替修饰DNA和二蛋白质HRP-Cyt c，制备二蛋白质多层膜界面。实验研究了组装层数对界面性能、蛋白质相互作用以及电子传输的影响。比较了二蛋白质多层膜界面与单蛋白质多层膜界面电催化性能的异同，优化了界面的构筑条件，揭示了蛋白质界面中信息的传递规律，测试了传感器的性能。基于此二蛋白质多层膜界面构建了高性能的H2O2电化学传感器。
　　 ⑷以Con A为载体的Cyt c-HRP三蛋白质单层膜界面的构建及H2O2电化学传感器的制备。先制备HRP单层膜电极，接着利用HRP的葡糖基与Con A进行特异性结合将Con A固载，再组装HRP-Cyt c混合蛋白质于电极上。Con A能和混合蛋白中的HRP结合，从而成功制备三蛋白质单层膜界面。Con A与HRP的特殊生物识别作用为HRP-Cyt c提供一个生物相容的微环境，同时三蛋白质之间能直接接触，使研究蛋白质的相互作用成为可能。实验中比较了三蛋白质单层膜界面与二蛋白质单层膜界面性能的异同，并构建了高性能的H2O2三蛋白质单层膜界面电化学传感器。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 生物传感器简介

1．1．1 生物传感器的发展

1．1．2 工作原理

1．1．3 生物传感器分类

1．2 电化学生物传感器简介

1．2．1 电化学酶生物传感器

1．2．2 电化学免疫传感器

1．3 几种广泛使用的酶或蛋白质的简介

1．3．1 葡萄糖氧化酶简介

1．3．2 细胞色素c简介

1．3．3 辣根过氧化物酶简介

1．4 酶生物分子固定化的传统方法

1．4．1 吸附法

1．4．2 共价键合法

1．4．3 包埋法

1．4．4 交联法

1．5 酶生物分子固定化的改进方法

1．5．1 采用新的载体材料

1．5．2 多酶(或蛋白质)联合固定化技术

1．6 本论文的选题目的及研究内容

参考文献

第二章 葡萄糖氧化酶／刀豆球蛋白A多层膜界面的构建及电化学葡萄糖传感器研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 修饰电极的制备

2．3 结果与讨论

2．3．1 (GOD／Con A)n／AuNPs-CHIT／GCE修饰电极的电化学行为修饰电极的制备

2．3．2 (GOD／Con A)3／AuNPs-CHIT／GCE修饰电极的电催化研究

2．3．3 (GOD／Con A)3／AuNPs-CHIT／GCE修饰电极的选择性、稳定性和重复性的研究

2．4 结论

参考文献

第三章 基于葡萄糖氧化酶-细胞色素c共固载于壳聚糖-金纳米粒子修饰电极的新型葡萄糖传感器

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 可见-紫外光谱样品的制备

3．2．4 修饰电极的制备

3．3 实验部分

3．3．1 GOD-Cyt c／AuNPS-CHIT／GCE修饰电极的原子力表征

3．3．2 GOD与Cyt c之间的相互作用

3．3．3 GOD-Cyt c／AuNPs-CHIT／GCE修饰电极的电化学行为

3．3．4 GOD-Cyt c／AuNPs-CHIT／GCE修饰电极的电催化研究

3．3．5 二蛋白质葡萄糖传感器的选择性、稳定性、重复性和重现性的研究

3．4 结论

参考文献

第四章 基于层层自组装的(DNA／细胞色素c-辣根过氧化物酶)n多层膜的电子传输及电催化研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 (HRP-Cyt c／DNA)n LBL膜的组装

4．2．4 可见-紫外光谱样品的制备

4．3 结果与讨论

4．3．1 (HRP-Cyt c／DNA)n LBL膜的原子力表征

4．3．2 (HRP-Cyt c／DNA)n LBL膜研究

4．3．3 (HRP-Cyt c／DNA)n多层膜修饰电极的直接电化学行为

4．3．4 多层膜修饰电极(HRP-Cyt c／DNA)n的电催化研究

4．3．5 二蛋白多层膜修饰电极的选择性、稳定性、重复性和重现性的研究

4．4 结论

参考文献

第五章 细胞色素c，辣根过氧化物酶和刀豆球蛋白A构筑的新型三蛋白质生物界面的电子传输及电催化研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3 Cyt c-HRP／Con A／HRP／MUA-MCH／Au修饰电极的制备

5．3 结果与讨论

5．3．1 三蛋白生物界面Cyt c-HRP／Con A／HRP／MUA-MCH／Au修饰电极原子力表征

5．3．2 三蛋白质生物界面修饰电极的电化学行为

5．3．3 三蛋白生物界面的电催化性质研究

5．3．4 三蛋白质传感器的选择性、稳定性、重复性和重现性的研究

5．4 结论

参考文献

论文总结

致谢

在读期间公开发表论文及科研情况