采煤塌陷地泥浆泵复垦土壤微生物多样性及土壤酶活性研究

摘要

土壤微生物多样性对于反映土壤肥力状况及生态环境演变具有重要的指示作用，一直是土壤生态学研究中的热点。国内外学者对矿区复垦土壤的物理、化学性质演变规律已进行了广泛而深入的探讨，但是对矿区复垦土壤微生物多样性的研究相对欠缺。
　　本文将传统的微生物培养方法和454焦磷酸测序的非培养方法相结合，从土壤微生物数量、土壤酶活性和微生物群落多样性三个方面，系统地研究了泥浆泵复垦影响下土壤微生物多样性与土壤酶活性的演变规律，揭示了土壤微生物多样性与土壤理化性质之间的相互关系，探明了复垦土壤微生物多样性演变的影响因素。主要研究结果如下：
　　(1)土壤微生物在三种土壤类型中的数量大小顺序为：对照土壤>复垦土壤>塌陷土壤，差异性显著(P<0.05)。采煤塌陷造成土壤微生物数量的显著下降，泥浆泵复垦显著增加了微生物数量，但与对照土壤相比仍然较少。相关分析表明，采煤沉陷及复垦改变了土壤有机质、总氮及速效磷含量，造成了微生物在不同类型土壤间的数量差异。在垂直分布上，微生物数量在对照土壤与复垦土壤均随土层深度的增加而递减。对照土壤剖面的微生物数量呈较明显的层次性，差异性显著(P<0.05)。复垦土壤各层的微生物数量差异不显著，这是因为泥浆泵复垦初期，土壤结构的剖面分异特征不明显、养分的剖面分布不均匀。塌陷土壤剖面的微生物数量呈无规律分布特征，表明采煤沉陷造成土壤微生物在垂直分布上的异质性。
　　(2)脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性在不同类型土壤中的大小顺序为：对照土壤>复垦土壤>塌陷土壤。复垦土壤中的酶活性较塌陷土壤显著提高，且逐渐接近对照农田水平。在垂直分布上，对照与复垦土壤的酶活性均随土层深度的增加而递减，反应了土壤酶的表聚性。塌陷土壤中酶活性的垂直分布规律因酶而异，表明采煤沉陷造成土壤酶活性在垂直分布上的复杂性。相关分析表明，土壤酶活性与土壤有机质、全氮、速效磷、含水量呈显著或极显著相关(P<0.05，P<0.01)；土壤微生物数量与土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶呈显著正相关(P<0.05)。土壤酶活性可敏感地指示复垦土壤理化性状和与土壤养分转化有关的微生物活性状况。
　　(3)基于宏基因组学和454高通量测序技术，获得土壤细菌16SrRNA V2-V3区的优化基因序列共76135条。比较三种土壤类型中的细菌遗传多样性指数、稀疏性曲线及Shannon-Wiener曲线发现，对照农田的细菌多样性水平最高，塌陷地最低。相关分析表明，土壤有机质、全氮和速效磷是影响土壤细菌遗传多样性的主要因素。采煤沉陷造成水土流失、土壤肥力退化，减少了土壤养分和能量对细菌群落的供给，使得细菌结构由复杂变为简单，多样性水平亦相应下降。复垦后，土壤有机质及土壤养分的改善，促进了细菌的繁殖，提高了细菌多样性水平。但复垦土壤细菌多样性仍低于对照农田。
　　(4)基于系统分类学，获得了细菌的29个门、54个纲、87个目、164个科、383个属。细菌的优势门类为:Proteobacteria(alpha-8.83％，beta-6.09%，gamma-10.28%,delta-4.47%)、Chloroflexi(14.85%)、Actinobacteria(9.60%)、Acidobacteria(8.11%)及Planctomycetes(7.01%)。优势菌群的相对丰度在不同类型土壤中存在明显差异，并与土壤理化性质密切相关。这体现出细菌群落的生态多样性以及与土壤环境的相互选择性，可以作为检测矿区土壤质量变化的生物学指标。
　　(5)细菌群落结构在塌陷土壤、复垦土壤和对照土壤中存在明显差异。聚类分析、主成分分析、Heatmap分析及FastUniFrac的群落差异性分析表明，塌陷土壤与对照土壤之间的差异显著。对照土壤的细菌群落结构较为复杂且菌种丰富，塌陷土壤的细菌菌种单一且分布不均匀。复垦改善了土壤细菌群落结构，与对照土壤具有一定相似性，但两者间仍存在差异。相关性分析和冗余分析表明，采煤塌陷及复垦引起土壤有机质、总氮和含水量等的变化，是造成细菌群落结构演变的主要原因。
　　(6)复垦土壤的微生物数量及酶活性具有明显的季节变化特征：夏、秋季的微生物数量较多、酶活性较高；春、冬季的微生物数量较少，酶活性较低。复垦土壤中，细菌多样性和细菌群落结构的季节变化特征不明显：细菌丰富度指数在夏、秋季较大，春、冬季较小；细菌多样性指数在春、秋季较大，夏、冬季较小。
　　(7)采煤塌陷使矿区农田土壤退化严重，破坏了微生物群落结构及多样性。泥浆泵复垦后土壤微生物数量与正常农田相比仍旧较少，酶活性及细菌群落多样性水平仍然较低。采煤塌陷地泥浆泵复垦应从改善土壤理化性状、提高土壤有机质和养分含量着手，并与土壤改良、植被修复等技术相结合，以恢复土壤肥力水平和微生物群落多样性。

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1 绪论

1.1 研究背景及意义（Research Background and Significance）

1.2 土壤微生物多样性(Soil Microbial Diversity)

1.3 国内外研究现状 (Current State in China and Abroad)

1.4 研究目标与内容(Research Objectives and Contents)

1.5 本章小结(Summary)

2 研究区概况与研究方案

2.1 基本概况(General Situation)

2.2 野外样区与复垦模拟实验(Field Zones and Simulation Experiment of Reclamation）

2.3 土样采集与处理 (Samples Collection and Processing)

2.4 样品测定方法（Determination Methods for Soil Samples）

2.5 数据统计分析(Statistic Analysis of Data)

2.6 本章小结(Summary)

3 泥浆泵复垦对土壤微生物数量及分布的影响

3.1 土壤主要理化性质分析（ Analyses of Soil Physical and Chemical Properties）

3.2 土壤微生物的分布和变化特征(Distributions and Changes of Soil Microorganism）

3.3 土壤微生物各类群的比例（ Proportions of Each Soil Microorganism Group）

3.4 土壤微生物与土壤理化性质之间的关系(Correlations between Soil Microorganism and Soil Properties)

3.5 本章小结(Summary)

4 泥浆泵复垦对土壤酶活性的影响

4.1 土壤酶活性的分布和变化特征（Distributions and Changes of Soil Enzyme Activities）

4.2 土壤酶活性与土壤理化性质之间的关系（ Correlations between Soil Enzyme Activity and Soil Properties）

4.3 土壤酶活性与土壤微生物之间的关系(Correlations between Soil Enzyme Activity and Soil Microorganism)

4.4 本章小结(Summary)

5 泥浆泵复垦对土壤细菌群落多样性的影响

5.1 454 焦磷酸测序结果及序列分析（ Results and Sequence Analyses of the 454 Pyrosequencing）

5.2 基于OTUs的细菌遗传多样性分析(OTUs-based Analysis of Soil Bacterial Genetic Diversity)

5.3 基于分类地位的细菌群落多样性分析(Taxonomy-based Analysis of Soil Bacterial Community Diversity)

5.4 土壤细菌群落相似度的聚类分析(Cluster Analysis of Soil Bacterial Community Similarity )

5.5 基于 OTUs的主成分分析(OTUs-based Principal Component Analysis)

5.6 基于OTUs的Heatmap热点图分析(OTUs-based Analysis of Heatmap)

5.7 土壤细菌遗传多样性与理化性质之间的关系（ Correlations between Bacterial Genetic Diversity and Soil Properties）

5.8 本章小结(Summary)

6 结论与展望

6.1 主要结论（Conclusions）

6.2 主要创新点（Innovations）

6.3 研究展望（Prospects）

参考文献

作者简历

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