半定量RT-PCR和SNPs技术分析两个鸡品种TCF3基因的表达水平及多态性

摘要

FCF3基因，(又称E2A，免疫球蛋白增强子结合因子E12/E47，ITFl)是一些细胞系的转录调节因子，编码一些组织生长和发育的碱性螺旋．环．螺旋(bHLH)家族的成员，如E12和E47。本次试验以京海黄鸡和苏禽黄鸡两个培育为研究对象，研究不同组织TCF3相对表达水平，筛选基因序列中的单核苷酸多态性(SNPs)以及它们与表型性状的相关性。每个品种于16周龄时随机选择30个混合性别的个体用于实验测定。全血提取基因组DNA，肾、肺和脾组织提取RNA。用分光光度计和电泳仪分别测定DNA和RNA的纯度和完整性。 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR．)的结果表明，在连续稀释的cDNA中移接变异的E12和E47的表达模式非常相似。两对引物用于RT-PCR．反应体系中分别扩增目标基因TCF3和看家基因。用ImageQuant软件计算出TCF3基因(T)与β-actin(C)扩增产物(μg)的相对表达水平之比(T/C)。结果表明，在肾，肺和脾组织中京海黄鸡(6.07±1.84，5.39±3.27和7.51±6.06)的相对表达水平高于苏禽黄鸡(5.12±3.57，3.91±2.48和4.52±3.12)，其肾、肺和脾组织中相对表达水平分别增加了18.55％，37.85％和66.15％。结果还表明，在这两个鸡品种中，肺和脾组织的表达水平差异显著(p<0.05)。两个鸡种中，公鸡的TCF3表达水平相应高于母鸡。而且在所有表达的组织中都有该趋势，且在肾和肺组织中公母鸡的差异显著(p<0.05)。由此推测TCF3相对表达水平有显著的性别效应。1`用单链构象多态性米分析(SSCP)两个鸡品种的TCF3基因的不同序列单核苷酸多态性(SNPs)。结果在京海黄鸡中没有发现SNPs。然而，在苏禽黄鸡中存在单核苷酸多态性，并用SSCP-PCR产物直接测序来验证。引物Exl401-Ex1402的SSCP-PCR产物测序发现在139 nt处有单核苷酸位点C-T突变。 哈代温伯格平衡(HWE)分析苏禽黄鸡TCF3基因引物Exl401-Ex1402的基因型频率和基因频率。引物Ex1401-Ex1402的等位基因A和B的频率在苏禽黄鸡中的频率分别为0.80和0.20，卡方检验表明引物Ex1401-Ex1402的基因型在苏禽黄鸡群体中差异不显著(p>0.05)。根据引物Ex1401-Ex1402单核苷酸位点分布，该群体处于哈代温伯格平衡状态。 不同组织中TCF13相对表达水平和引物Ex1401-Ex1402单核苷酸位点多态性的基因型相关分析表明：苏禽黄鸡不同组织中AA基因型的表达水平高于AB的表达水平。肾、肺和脾中AA基因型的表达水平分别为5.762±4.004，4.290±2.212和5.059±3.249，而AB基因型的表达水平相应的分别为4.272±2.883，3.435±2.867和3.106±2.506。基因型AA和AB在脾组织中的相对表达水平呈极显著相关(P<0.01)。 活体重和TCF3在鸡的。肾、肺和脾组织中相对表达水平用最小显著差数法(LSD)分析其差异显著性，结果表明差异不显著；但是AA基因型个体的相对表达水平高于AB基因型个体。不考虑基因型差异，在两性中肾和肺的相对表达水平差异显著(p<0.05)。AA型公鸡的相对表达水平高于AA型的母鸡。相反，AB型母鸡的相对表达水平高于AB型的公鸡。 不同组织中通过测定mRNA的水平来检测基因表达的差异，并产生一个可测定的信号用于量化测定，半定量RT-PCR法是检测基因表达微妙差异的一种灵敏方法，这些差异比RNA装载更能反应表达水平的真实变化。此外，个体特定基因的相对表达的变化与其它表型性状，单核苷酸多态性(SNPs)和分离DNA序列变异的常见类型之间的相关性是判定等位基因和基因相对表达水平之间相关性的一种可靠的基因分型方法。

目录

文摘

英文文摘

1.文献综述

2.SNPs技术检测TCF3基因的多态性

2.1试验动物

2.2主要仪器和药品

2.3溶液配置

2.4实验方法

2.4.1鸡血液基因组DNA的提取方法

2.4.2 DNA浓度和纯度的检测

2.5引物设计、合成与稀释

2.5.1引物的设计

2.5.2引物的合成与稀释

2.6目的片段的检测

2.6.1最佳PCR反应条件和反应体系的建立

2.6.2 NDA片段的琼脂糖检测

2.6.3 PCR-SSCP技术

2.6.4利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行SSCP分析

2.6.5硝酸银染色方法

2.7基因型的判定

2.8遗传学统计分析

2.8.1相关软件

2.8.2统计方法

2.9结果与分析

2.9.1引物PCR扩增产物的非变性PAGE胶检测

2.9.2 PCR-SSCP分析结果

2.9.3序列分析结果

2.9.4数据统计及结果分析

2.9.5 TCF3基因与16周龄苏禽黄鸡生产性能的相关性

2.10讨论

3.半定量RT-PCR检测TCF3基因的表达差异

3.1试验对象及样本采集

3.2主要仪器和设备

3.3常规溶液及试剂配制

3.3总RNA的提取、纯化及检测

3.3.1总RNA的提取

3.3.2总RNA的纯化、检测

3.4引物设计

3.5 RT-PCR

3.5.1反转录酶及RT-PCR试剂盒

3.5.2反转录准备工作

3.5.3 First-Strand cDNA合成

3.5.4 PCR扩增1st strand cDNA

3.6统计学 图像处理

3.7结果和分析

3.7.1总RNA的琼脂糖电泳检测

3.7.2 TCF3的表达模式

3.7.3 TCF3基因在两个鸡品种不同组织的表达差异检测

3.7.4 TCF3基因在两个鸡品种不同性别中的表达差异检测

3.7.5 TCF3基因在不同组织中的表达水平与生产性能的相关性分析

3.7.6 TCF3基因在不同组织中的表达水平与基因型的相关性分析

3.8讨论

4.全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文