2007年江苏地区猪高热病病例中PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、JEV、EMCV、PEV、PTV的检测和区分猪瘟野毒、疫苗毒荧光定量RT-PCR方法的尝试

摘要

根据GenBank中已发表的序列，设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)Nsp2基因和猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)5'-NCR的特异性引物，建立针对上述两种RNA病毒的多重RT-PCR方法，可同时扩增出相应的743 bp和288 bp的目的片段，并且针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物能够区分PRRSV是否为缺失株，若为缺失株，扩增片段小于743 bp。实验结果表明此多重RT-PCR方法特异、敏感、快速，具有广阔的应用前景。 同时根据GenBank中已发表的序列，设计了针对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)和日本乙型脑炎病毒(Japanese encephaliftsvirus，JEV)的保守区域的特异性引物，分别扩增出284 bp和1057 bp的目的片段。参照有关文献，采用nRT-PCR的方法检测猪肠病毒(porcine enterovirus，PEV)和猪捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)，根据GenBank中已发表的PEV和PTV的血清型序列，针对猪捷申病毒PTV-1～PTV11、猪肠病毒PEVB的5'-NTR或肠病毒PEVA的3D聚合酶基因，采用三套引物，通过nRT-PCR的方法能够检出所有PEV和PTV的血清型的病毒，扩增的片段分别为158bp、221bp和313bp。实验结果表明上述PCR方法特异、敏感、快速，具有广阔的应用前景。 应用上述PCR方法以及本实验室已经建立的检测猪圆环病毒2型(porcinecirvovirus type 2，PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)的多重PCR方法，对来自江苏地区的141份猪高热病病料进行检测，结果显示6l份病料为PCV2阳性，阳性率为43.3％；96份病料为PRRSV阳性，阳性率为68.1％；69份病料为CSFV阳性，阳性率为48.9％；67份病料为PTv阳性，阳性率为47.5％；34份病料为PEVB阳性，阳性率为24.1％；9份病料为EMCV阳性，阳性率为6.4％；PPV、PRV、厄V、PEVA均未为检出；其中PCV2、PRRSV混合感染阳性率最高，141份病料中有52份，占总数的36.9％，且有12份为PRRSV、PCV2和CSFV的三重混合感染，占总数的8.5％，同时，PCV2、PRRSV、PTV的混合感染有8份，占总数的5.7％；在混合感染病例中，PRRSV和CSFV混合感染居第二，14l份病料中有41份，占总数的29％，PRRSV和PTV的混合感染为第三，141份病料中有35份，占总数的24.8％。猪瘟是一种传染性强、致病性高、危害最为严重的猪烈性传染病之一，本次调查中CSFV的阳性率高达48.9％，其对猪高热病的协同致病作用显而易见。综合本次调查结果，在猪高热病病原尚未明确的情况下，老的传染病并未得到有效控制，如猪瘟；新的传染病不断被检测出来，如PRRS和圆环病毒感染相关疾病(porcine cirvovirus disease，PCVD)。值得注意的是，猪捷申病毒和猪肠病毒感染，在我国猪群中的流行病学研究罕见报道，对2007年猪高热病病例中两病的流行病学调查结果表明，PTV的阳性率占47.5％，PEVB阳性率占36.9％，流行情况是严重的。上述检测结果足以说明我国猪高热病的复杂性及防治的艰巨性。 本研究试图摸索一种复合荧光定量RT-PCR方法，用于CSFV野毒株与兔化弱毒疫苗株的鉴别诊断。通过对GenBank中公布CSFV野毒和弱毒疫苗株基因组序列的比较分析，在其5'端非编码区设计了一对针对CSFV的通用引物和两条分别针对CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan探针，希望建立一种能区分CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株的敏感、特异、重复性好的复合荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法，但所建立的方法并不能区分CSFV野毒和疫苗株的感染，这方面的工作还需继续努力。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

论文研究一、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒多重RT-PCR方法的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

论文研究二、检测日本乙型脑炎病毒和脑心肌炎病毒的RT-PCR方法的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

论文研究三、检测猪捷申病毒和猪肠病毒的nRT-PCR方法

1材料与方法

2结果

3讨论

论文研究四、2007年江苏地区猪高热病病例中9种猪病病毒的流行病学调查

1材料与方法

2结果

3讨论

论文研究五、区分猪瘟野毒株与兔化弱毒疫苗株的荧光定量RT-PCR方法的尝试

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文小结

致谢