猪细小病毒结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1主要抗原区的原核表达以及间接VP2-ELISA检测方法的建立

摘要

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起的以母猪特别是初产母猪不孕、流产，产出死胎、畸胎、木乃伊胎以及弱仔为特征的繁殖障碍性疾病。该病在全球范围内广泛存在，给养猪业造成了重大的经济损失。为了加强对该病的疫情监测和流行病学调查，有必要研究开发出一种特异性强和敏感性高的血清学检测试剂。PPV的结构蛋白VP2(Structural Protein2)具有良好的免疫原性，可作为理想的血清学检测用抗原[1]。另外，PPV持续感染的猪体内会产生抗非结构蛋白NSI(Nonstructural Protein1)的抗体，据此，NS1可作为诊断用抗原来区别灭活苗免疫和自然感染。 本研究利用大肠杆菌表达系统表达了PPV VP2和NS1蛋白的主要抗原表位区，获得了纯化的重组蛋白，用纯化的VP2重组蛋白初步建立了间接VP2-ELISA，并对NS1重组蛋白的适用性进行研究。主要研究内容如下： 一、猪细小病毒结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1主要抗原区的原核表达 参照GenBank发表的PPV中国株基因序列，分别设计出针对VP2和NS1的引物，通过PCR方法扩增出包含VP2和NS1主要抗原表位区509bp和698bp的基因片断，克隆到pGEM-T-Vector上，再分别插入到原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游，建立pET-VP2和pET-NS1两个重组表达载体，将载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，表达产物分子量大小分别为39.1KDa和45KDa。经BandScan软件分析，表达量分别占菌体蛋白的65.2％和53.1％。Western-blot分析结果表明，表达的重组蛋白均能与PPV阳性血清发生特异性反应。表达产物经His·Bind亲和层析法纯化后，获得的重组蛋白VP2和NS1的浓度达到1.53mg/ml和0.35mg/ml。 二、猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法的初步建立 将纯化后的重组蛋白VP2作为抗原包被聚乙烯微量反应板，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，初步建立了针对VP2抗体的间接VP2-ELISA。对ELISA各种反应条件进行优化，确定了最适工作条件。研究结果表明，重组抗原最适包被浓度为306ng/孔，4℃包被过夜，待检血清最适稀释度为1:50。待检血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃，30min和37℃，15min；底物37℃显色10min，读OD450值。血清样品OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判为阳性。用建立的间接VP2-ELISA分别检测猪圆环病毒病、伪狂犬病、猪瘟、猪日本脑炎和猪繁殖与呼吸综合征阳性血清，结果均为阴性，说明该方法具有高度的特异性。批间、批内重复性试验结果变异系数均小于10％。 与Ceditest()PPV ELISA试剂盒相比，间接VP2-ELISA方法的敏感性和特异性分别为93.8％(61/65)和81.1％(30/37)，符合率为89.2％(91/102)。说明该方法具有较好的敏感性和特异性，可用于PPV血清抗体的检测。

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文摘

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论文说明：符号说明

声明

综述 猪细小病毒研究进展

1 PPV病原学特性

2 PPV感染的流行病学

3 PPV的分子生物学研究进展

4猪细小病毒病的临床症状及病理变化

5 PPV诊断方法的研究进展

6 PPV的疫苗研究

第一部分猪细小病毒结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1主要抗原区基因的原核表达

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分猪细小病毒抗体间接VP2-ELISA检测方法的初步建立

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文