黄芩茎叶总黄酮对高甘油三酯血清诱导的血管内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

摘要

随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，以及人口老龄化的迅速到来，心脑血管疾病已成为当今世界上危害人类生命和健康的最主要的疾病。动脉粥样硬化(arterio sclerosis，AS)是心脑血管疾病的重要病理基础，而血管内皮细胞损伤是AS发生的始动环节。近年来，国内外研究表明，高甘油三酯(hightriglyceride，HTG)血症是导致AS发生的独立危险因素，它可通过损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞增殖、引起脂质过氧化、促进血栓形成等启动AS。在高甘油三酯血症导致AS的过程中，由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多引起的氧化应激所致的内皮细胞损伤可能起到了极其重要的作用。活性氧是调节血管功能状态的重要信号分子，在生理和病理情况下，体内有多种酶参与了ROS的生成。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase)目前被认为是血管内生成ROS的主要酶体，内皮细胞主要表达NADPH氧化酶家族(NOX)中的NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4，NOX4)。那么，在HTG诱导内皮细胞氧化损伤过程中，是否通过NADPH氧化酶途径?目前关于这一研究国内外还未见报道，这正是本课题所要研究的内容之一，期望从新的角度揭示高甘油三酯血症致AS的机制并为其防治提供理论依据。
　　 黄芩茎叶总黄酮(scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid，SSTF)为黄芩茎叶的提取物，其主要成分为黄酮类化合物。已进行的药理学研究表明，SSTF对心脑血管系统具有广泛的作用，如抗氧化、降血压、调血脂、改善心脑血管的供血等。那么，SSTF对HTG诱导的内皮细胞氧化损伤是否有保护作用?其保护作用机制是否与抑制NADPH氧化酶表达有关?这是本课题所要研究的另一内容，研究结果有助于为寻找新的抗AS药物作用靶点提供实验依据。
　　 目的：
　　 1.研究人高甘油三酯(HTG)血清对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氧化损伤效应，特别是NADPH氧化酶亚型NOX4在HTG致HUVEC氧化损伤中的作用。
　　 2.观察黄芩茎叶总黄酮(SSTF)对HTG诱导的HUVEC氧化损伤的保护作用，并从分子水平探讨其作用机制。
　　 方法：
　　 1.HTG对HUVEC的氧化损伤效应：体外培养HUVEC，分别加入1％、2％、3％、4％、5％的HTG作用于细胞，在8h、12h、16h、20h及24h，通过四唑氮(MTT)比色法测定各组细胞活力(OD值)，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸反应物(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量，流式细胞仪(FCM)检测细胞内活性氧(ROS)水平，观察HTG对HUVEC的氧化损伤效应，并确定最佳的HTG作用浓度和时间。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化损伤中的作用：体外培养HUVEC，加入5％HTG作用于细胞16h，通过RT-PCR法检测NOX4 mRNA表达，Western blot法检测NOX4蛋白表达，观察HTG刺激后HUVEC中NOX4的表达情况。
　　 3.SSTF对HTG致HUVEC氧化损伤的保护作用：终浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF以及阳性对照药物100mg/L的VitC分别与HTG氧化损伤的HUVEC共同孵育16h，通过检测细胞活力、SOD活性、MDA含量及ROS水平的变化，观察SSTF的保护作用，并与VitC相比较。
　　 4.SSTF对HTG致HUVEC氧化损伤的保护作用机制：终浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF分别与HTG氧化损伤的HUVEC共同孵育16h，通过RT-PCR法检测NOX4 mRNA表达，Western blot法检测NOX4蛋白表达，观察SSTF作用后HUVEC中NOX4的表达变化。
　　 结果：
　　 1.HTG对HUVEC的氧化损伤效应：MTT结果显示，与Control组相比，4％的HTG作用24h、5％的HTG作用16h以上对HUVEC活力(OD值)有明显抑制作用(P<0.01)，并呈现时间和浓度依赖关系；SOD结果显示，与Control组相比，2％的HTG作用24h、3％及4％的HTG作用20h以上、5％的HTG作用16h以上可引起HUVEC的SOD活性明显降低(P<0.01)，并呈现时间和浓度依赖关系；MDA结果显示，与Control组相比，2％的HTG作用20h以上、3％的HTG作用16h以上、4％及5％的HTG作用8h以上可引起HUVEC中MDA含量明显增加(P<0.01)，并呈现时间和浓度依赖关系；ROS结果显示，未加HTG刺激时，HUVEC内可以检测到一定量的ROS，表明基础状态下细胞内也有ROS产生，给予HTG刺激后细胞内ROS明显增加，与Control组相比，1％HTG作用16h以上、2％HTG及以上浓度作用8h以上均可引起细胞内ROS明显增加(P<0.01)，并呈现时间和浓度依赖关系，尤以5％HTG作用16h增加最为明显。结合以上，实验结果确定本实验HTG最佳氧化损伤浓度为5％，最佳作用时间为16h。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化损伤中的作用：RT-PCR结果显示，未加HTG刺激的HUVEC内有NOX4 mRNA表达，给予HTG刺激后，细胞内NOX4mRNA表达明显增加，与对照组相比，有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果显示，未加HTG刺激的HUVEC内有NOX4蛋白表达，给予HTG刺激后细胞内NOX4蛋白表达明显增加，与对照组相比，有统计学意义(P<0.01)。
　　 3.SSTF对HTG致HUVEC氧化损伤的保护作用：MTT结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF和100mg/L的VitC都能增加受损细胞活力(OD值)，尤以400mg/L的SSTF和100mg/L的VitC为明显(P<0.01)；SOD结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF和100mg/L的VitC都能明显升高氧化损伤细胞的SOD活性(P<0.05或P<0.01)；MDA结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF和100mg/L的VitC都能显著降低HUVEC的MDA含量(P<0.01)；ROS结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF和100mg/L的VitC都能显著减少HUVEC内ROS的生成(P<0.01)。
　　 4.SSTF对HTG致HUVEC氧化损伤的保护作用机制：RT-PCR结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF都能下调HTG氧化损伤的HUVEC中NOX4 mRNA表达，除100mg/L的SSTF外，均有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果显示，与HTG组相比，各浓度组的SSTF均能显著下调HTG氧化损伤的HUVEC的NOX4蛋白表达(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.高甘油三酯血清能够诱导血管内皮细胞氧化损伤，其氧化损伤的程度与高甘油三酯血清的浓度呈现依赖关系。
　　 2.高甘油三酯血清诱导的血管内皮细胞氧化损伤可能通过NADPH氧化酶途径，NOX4作为内皮细胞NADPH氧化酶的主要表达形式，在此氧化损伤过程中可能起一定作用。
　　 3.SSTF对高甘油三酯血清诱导的血管内皮细胞氧化损伤具有保护作用，能提高内皮细胞抗氧化能力、抑制脂质过氧化效应、减少细胞内活性氧生成。
　　 4.SSTF可下调高甘油三酯血清氧化损伤的血管内皮细胞中的氧化酶NOX4的mRNA和蛋白表达，提示SSTF可能通过抑制NADPH氧化酶表达进而减少ROS的生成来发挥它的抗氧化作用。