四种鸡艾美球虫ITS区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究

摘要

鸡球虫病(Coccidiosis)是由寄生于肠消化道上皮细胞的艾美属(Eimeria)球虫引起的一种对养鸡业危害及其严重的寄生性原虫病。其病原有堆型艾美球虫(E.acervulina)、布氏艾美球虫(E.brunetti)、巨型艾美球虫(E.maxima)、和缓艾美球虫(E.mitis)、毒害艾美球虫(E.necatrix)、早熟艾美球虫(E.praecox)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)等7个种，在临床上常为几种球虫混合感染，因此鸡球虫纯种的分离与鉴定是开展鸡球虫生物学与分子生物学、免疫学与疫苗学等研究的基础。为此，本研究采用单卵囊分离技术，分别建立了早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫纯种株，并对分离的3种球虫与本室保存的4株巨型艾美球虫的ITS全序列进行了克隆与测序，在分子水平上对其进行了进一步的鉴定，并探讨了不同种和同种不同株间球虫的系统进化关系，为鸡艾美球虫的鉴别诊断和分子流行病学调查奠定基础。同时，本研究还探讨了毒害艾美球虫与巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫间在免疫上的相互影响，旨在为今后鸡球虫病的免疫预防奠定基础。
　　 1、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫的分离与鉴定
　　 采用单卵囊分离技术，获得了2株纯种球虫，鉴定为和缓艾美球虫与早熟艾美球虫。主要鉴定指标：和缓艾美球虫：卵囊呈球形或亚球型，囊壁光滑无色，卵囊内有1极体，无内、外残余体；测100个卵囊的平均大小为(14.96±1.38)μm×(13.65±1.20)μm，测100个孢子囊的平均大小为(9.23±1.20)μm×(5.29±0.53)μm；潜在期96 h，最短孢子化时间15.5 h；虫体主要寄生于小肠下段。早熟艾美球虫：卵囊呈椭圆形或卵圆形，有极体，无内、外残余体；测100个卵囊的平均大小为(19.21±2.10)μm×(16.40±1.75)μm，测100个孢子囊的平均大小为(10.62±0.90)μm×(6.85±0.75)±μm；潜在期84 h，最短孢子化时间20 h；虫体主要寄生于鸡十二指肠与空肠前段。分别用此2株纯种球虫的孢子化卵囊20×104、60×104个感染30日龄黄羽肉鸡各10只，另设1个不感染对照组，结果感染2株纯种球虫的鸡均未发生死亡，但平均增重与不感染对照组差异显著(P<0.05)，感染和缓艾美球虫的2组鸡肠道均出现可见病变，感染早熟艾美球虫的2组鸡肠道病变记分为零。
　　 2、毒害艾美球虫的分离与鉴定
　　 采用单卵囊分离技术从田间样本分离到一株纯种艾美球虫，经鉴定为毒害艾美球虫。该球虫卵囊呈长卵圆形，囊壁光滑，卵囊内有一极体，无卵膜孔和卵囊残体；测100个卵囊大小(12.25～25.00)μm×(12.50～30.00)μm，平均大小(16.53±3.12)μm×(18.76±3.44)μm，形状指数1.14；孢子囊呈长卵圆形，壁上含有一斯氏体，但无孢子囊残体；测100个孢子囊大小(4.00～7.10)μm×(9.00～14.00)μm，平均大小(5.91±0.68)μm×(10.91±0.91)μm；测50个第二代裂殖体大小(32.50～75.00)μm×(28.00～62.50)μm，平均大小(50.77±11.77)μm×(44.44±9.51)μm；测25个裂殖子大小(1.50～3.00)μm×(9.50～12.50)μm，平均大小(2.41±0.27)μm×(10.51±0.93)μm；潜在期为145 h；最短孢子化时间19 h；卵囊主要寄生于盲肠。用纯种球虫的孢子化卵囊，以0.5×104、1×104、5×104的剂量分别感染30日龄黄羽肉鸡各10只，并设置批内重复，另设一不感染对照组。结果显示感染1×104组和5×104组鸡出现死亡，其中5×104感染组死亡率为30％～40％，感染1×104组的死亡率为0％～10％；感染0.5×104组和1×104组平均增重与不感染对照组之间无显著差异，感染5×104组平均增重与不感染对照组相比差异极显著(P<0.05)。感染组鸡肠道均出现病变，以感染5×104组最高。
　　 3、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球及4株巨型艾美球虫虫ITS全序列克隆与序列分析
　　 为进一步从分子水平上确认单卵囊分离所得的早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫及本实验室分离保存的4株巨型艾美球虫为纯种艾美球虫，以及探讨这些球虫分离株间的亲缘关系，设计了1对种属特异性引物，对上述4种7株球虫的ITS全序列进行PCR扩增、克隆、测序，并与GenBank中所登录的相应虫种的ITS序列进行系统发育进化分析。结果显示：早熟艾美球虫扩增片段大小为1084 bp、和缓艾美球虫扩增片段大小为1037 bp、毒害艾美球虫扩增片段大小为1.337 bp、巨型艾美球虫扬州株扩增片段大小为980 bp、巨型艾美球虫上海株扩增片段大小为875 bp、巨型艾美球虫美国疫苗株扩增片段大小为876 bp、巨型艾美球虫南通株扩增片段大小为1008 bp。几种球虫之间的同源性在50.8％～99.1％之间，平均遗传距离为0.49。在构建的系统发育进化树中显示各种球虫分别与GenBank中下载的对应虫种处在同一分支上；在4株巨型艾美球虫间，上海株与美国疫苗株形成一个分支，序列间相似性为96.9％，扬州株和南通株处于另一大的分支上，序列间相似性为99.1％。和缓艾美球虫与序列号为FJ230365的和缓艾美球虫一起处于最小分支，毒害艾美球虫与各柔嫩艾美球虫参考株一起形成一个大的支系，早熟艾美球虫则单独形成一个分支与其它各大的分支并列。
　　 4、毒害艾美球虫与巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫间在免疫上的相互影响
　　 以黄羽肉鸡为试验动物，分别以死亡率、肠道病变记分、平均增重、相对增重率、相对卵囊产量、抗体水平等为评价指标，分别探讨了毒害艾美球虫与巨型艾美球虫(两者在裂殖生殖阶寄生部位相同)、毒害艾美球虫与柔嫩艾美球虫(两者在配子生殖阶段寄生部位相同)间在免疫上的相互影响。结果显示：巨型艾美球虫与毒害艾美球虫混合免疫，免疫保护效果较毒害艾美球虫单独免疫的要高，显示巨型艾美球虫对毒害艾美球虫的免疫有一定的协同效应；而毒害艾美球虫对巨型艾美球虫的免疫有一定的负面影响，但不显著。柔嫩艾美球虫与毒害艾美球虫混合免疫与毒害艾美球虫单独免疫相比，前者的免疫保护力大于后者，显示柔嫩艾美球虫对毒害艾美球虫的免疫有一定的协同效应：而毒害艾美球虫对柔嫩艾美球虫的免疫没有影响。