基于rpoB基因的非结核分枝杆菌菌种鉴定PCR-RFLP方法的研究

摘要

非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合物均可引起肺部和全身其它部位病变,而且症状类似,临床鉴别诊断困难。传统以细菌培养为基础的表型和生化鉴定分枝杆菌的方法,耗时耗力,不能及时提供结果用于临床诊断,而且有时结果不够准确而导致错误诊断。因此,分枝杆菌菌种鉴定对于疾病的诊断、治疗及预后意义重大。
　　 近20年来,随着分子生物学技术的飞速发展和日益成熟,出现了众多以分子生物技术为基础的菌种鉴定方法,如DNA直接测序法、DNA探针、DNA芯片、PCR-SSCP、PCR-RFLP等方法。并以其快速、特异、高效等优点而受到广泛关注。本研究以rpoB作为靶基因和分枝杆菌标准菌种进行PCR-RFLP方法研究,旨在建立分枝杆菌快速鉴定PCR-RFLP操作方案和RFLP标准指纹图谱,为临床快速、准确鉴别诊断提供可靠的参考标准。
　　 1.基于rpoB基因的非结核分枝杆菌菌种鉴定PCR-RFLP方法的建立和初步评价
　　 本研究分别对181株111种分枝杆菌标准菌株的rpoB基因360bp片段特异片段进行PCR扩增,PCR产物用测序和限制性片段长度多态性(RFLP)分析。HaeⅢ和MspⅠ联合应用获得90种特异图谱(NP1-90),可鉴别77种非结核分枝杆菌;对余下34种难以鉴定到种者,应用生物信息学方法从197种限制性内切酶中筛选到的TauⅠ和AccⅡ进行模拟酶切预测。结果HaeⅢ,MspⅠ和TauⅠ联合应用获得32种特异图谱(NP91-122),可鉴定27种;对其余7种无法鉴定到种者,再以HaeⅢ,MspⅠ,TauⅠ和AccⅡ联合应用获得2种特异图谱(NP123-124),可鉴定2种。到此,还有5种无法鉴定。本研究建立的PCR-RFLP方法共得到124种特异性图谱,能明确鉴定106种非结核分枝杆菌,为临床分枝杆菌鉴定和防治研究提供了良好的基础。
　　 2.动物标本分枝杆菌分离培养和鉴定
　　 用碱处理法消化处理动物临床标本,分别接种微酸L-J固体培养基和Mgit960液体培养基培养分枝杆菌;用选择性PNB/TCH培养基、IS6110-PCR、多位点PCR和PCR-RFLP对分离菌株进行鉴定。共从506份动物标本分离到15株分枝杆菌,其中28份PPD阳性牛淋巴结标本分离到8株分枝杆菌,分离率为28.6％;478份PPD阴性的健康动物随机盲采标本分离到7株分枝杆菌,包括猪源4株,分离率为1.2％(4/326)、牛源3株,分离率为2.0％(3/152);经鉴定,10株为非结核分枝杆菌,包括2株耻垢分枝杆菌、4株草分枝杆菌、1株杜氏分枝杆菌、1株浅黄分枝杆菌、1株偶发分枝杆菌和1株未定种;5株为结核分枝杆菌复合物,包括3株结核分枝杆菌和2株牛分枝杆菌。