禽病原性大肠杆菌E058株和尿道致病性大肠杆菌U17株neuC、proP基因突变株的构建及其致病性评价

摘要

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前，该病已成为危害养禽业的重要细菌病，给养禽业带来严重威胁和造成重大经济损失。
　　 尿道感染(urinarytractinfections，UTIs)在人类疾病中是比较常见的，大部分妇女都会经历一次尿道感染。迄今，尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicEscherichiacoli,UPEC)是尿道感染中最常见的病原体。UPEC通过自身所带的毒力因子黏附并侵入宿主，突破宿主的防御系统，引起组织的损伤。UPEC在肠道外的生长能力使得它们能引起尿道感染在内的各种疾病。
　　 基于APEC和UPEC的致病潜能，APEC和UPEC被归为新型致病性大肠杆菌—肠道外病原性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC)。由于APEC和UPEC在肠道外感染中可能会面临宿主相似的挑战，它们可能具有某些相似的致病基因和致病能力。很多研究证明，APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。
　　 我们之前的研究利用DNA芯片分别对APECE058株和UPECU17株在鸡体内和体外的转录子进行了分析，结果显示neuC基因呈显著上调趋势，同时我们通过选择性捕获转录序列方法得出proP基因可能跟致病性相关。因此，本研究中选择构建neuC和proP这两个基因的突变株并评价其与致病性之间的关系。
　　 运用Red重组系统构建E058△neuC、U17△neuC、E058△proP、U17△proP基因缺失突变株。Southernblot结果显示Kanamycin和Zeocin抗性基因在E058△neuC、U17△neuC和E058△proP、U17△proP质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明E058△neuC和U17△neuC的neuC基因不能转录，E058△proP和U17△proP的proP基因不能转录，而相关基因的上下游基因的转录并未受影响。在血清杀菌实验中，与野生株E058和U17相比，E058△neuC和U17△neuC在血清中的存活率下降(P＜0.05)，而E058△proP和U17△proP与野生株相似。巨噬细胞HD11的吞噬结果显示，与野生株E058和U17相比，E058△neuC和U17△neuC突变株的吞噬率显著升高，而E058△proP和U17△proP突变株的吞噬率跟野生株相当。体内竞争结果表明，在35日龄的SPF鸡体内，与野生株E058、U17相比，突变株E058△neuC和U17△neuC竞争性生长能力显著下降（P＜0.001或P＜0.0001），说明突变株被高度致弱，但是E058△proP和U17△proP突变株和野生株E058和U17相比没有差异。体内动态分布实验中，E058△neuC和U17△neuC突变株在受检脏器中的细菌数较APECE058株和UPECU17株均明显下降，其中在心、肝、脾、肾中下降特别明显(P＜0.0001)，在肺中下降也很明显(P＜0.001)，而E058△proP和U17△proP突变株在受检脏器中的细菌数与APECE058株和UPECU17株类似。上述结果显示，neuC基因与APECE058株和UPECU17株的致病性有较强关联，而proP基因与APECE058株和UPECU17株的致病性无关。

目录

摘要

符号说明

综述

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 分子生物学及数据分析软件

1．5 试验鸡

2 方法

2．1 T-neuC-Kan、T-proP-Zeo重组质粒的构建

2．2 电转化亲本株E058和U17构建突变株E058△neuC、E058△proP、U17△neuC、U17△proP

2．3 Southern杂交

2．4 RT-PCR

2．5 细菌生长曲线的测定

2．6 SPF鸡血清的杀菌性实验

2．7 HD11细胞的吞噬实验

2．8 体内外竞争试验

2．9 体内分布试验

3 结果

3．1 neuC片段及neuC片段克隆入pMD?18-T载体中的鉴定

3．2 proP片段及proP片段克隆入pMD?18-T载体中的鉴定

3．3 Kanamycin抗性基因及Zeocin抗性基因的获得

3．4 重组质粒T-neuC-Kan的构建

3．5 重组质粒T-proP-Zeo的构建

3．6 突变株的构建与鉴定

3．7 Southern blot结果

3．8 RT-PCR结果

3．9 生长曲线结果

3．10 血清杀菌试验结果

3．11 细胞吞噬试验结果

3．12 体外和体内竞争结果

3．13 35日龄SPF鸡体内动态分布试验结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

声明