TR1基因双元载体的构建及其转化

摘要

油菜（BrassicanapusL.）是一种经济价值很高的作物，在食用植物油和饲用蛋白质供给中发挥着非常重要的作用。随着气候变暖趋势的不断发展，高温逼熟现象对油菜的品质和产量负面影响越来越大。将耐热基因TR1导入甘蓝型油菜中，有望培育出抗高温的转基因油菜新品种。本研究以甘蓝型油菜的下胚轴为外植体，研究了油菜遗传转化和再生的一些影响因素，并利用农杆菌介导法将TR1基因导入油菜。主要工作和研究结果如下:
　　 1、建立并优化了油菜下胚轴遗传再生体系
　　 比较了2种常用的灭菌方法，发现乙醇结合次氯酸钠消毒法既能保证灭菌效果，又不会明显降低油菜种子萌发率，更适合油菜种子灭菌。比较了油菜绿苗和黄化苗下胚轴的出愈率，发现前者较高。在对共培养和筛选的研究中发现，下胚轴在加了菌液的液体共培养基中共培养3天是较好的共培养方法;把共培养后的外植体先延迟培养4天，比直接进行筛选有更高的出愈率和芽再生率;另外，通过梯度实验，抗生素浓度卡那霉素10mg/L，潮霉素2.5mg/L较为合适。
　　 2、转TR1基因植株的获得与鉴定
　　 对筛选得到的284棵抗性苗进行PCR分析，有2棵呈阳性反应，阳性率为3.7％。对这两株植株进行了PCR-Southern和Southern杂交，表明TR1基因整合到油菜的基因组中。
　　 3、构建了双T-DNA的双元载体pSB130-TR1，可用于遗传转化，为培育不含抗性选择标记的转基因油菜奠定了基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 高温胁迫对油菜的影响

1．2．1 高温对油菜生长发育的影响

1．2．2 高温对油菜品质及产量的影响

1．2．3 高温对油菜光合作用和呼吸作用的影响

1．2．4 高温对油菜生物膜和抗氧化系统的影响

1．3 TR1基因

1．4 转基因作物中选择标记基因的安全性

1．4．1 植物基因转化中常用的标记基因

1．4．2 选择标记基因去除的必要性

1．4．3 选择标记基因去除的方法

1．5 转基因油菜的检测

1．5．1 个体或组织水平上的检测

1．5．2 DNA水平上的检测

1．5．3 RNA水平上的检测

1．5．4 蛋白质水平上的检测

1．6 研究目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒及菌种

2．1．3 实验中主要使用的试剂及培养基

2．1．4 主要仪器设备

2．2 TR1双T-DNA区双元载体的构建

2．2．1 TR1基因的获得

2．2．2 载体的连接与验证

2．2．3 连接产物转化大肠杆菌

2．2．4 连接产物转化农杆菌

2．2．5 质粒DNA的提取与转化

2．2．6 转TR1基因再生植株的获得

2．2．7 农杆菌介导的油菜下胚轴再生体系的优化

2．2．8 再生植株的分子检测

第三章 结果与分析

3．1 TR1双T-DNA区双元载体的构建

3．2 农杆菌介导的油菜下胚轴转化体系的优化

3．2．1 种子灭菌方法的选择

3．2．2 种子萌发条件的选择

3．2．3 共培养方法对出愈率和再生率的影响

3．2．3 延迟培养对出愈率和再生率的影响

3．2．4 筛选抗生素浓度的确定(未侵染)

3．3 转TR1基因油菜植株的获得与鉴定

3．3．1 转基因油菜植株的获得

3．3．2 转基因油菜植株的与PCR鉴定

3．3．3 转基因油菜植株的PCR-Southern杂交

3．3．4 PCR阳性植株的Southern杂交

第四章 讨论

4．1 农杆菌介导的油菜下胚轴转化体系的优化

4．2 转TR1基因油菜植株鉴定

参考文献

附录

致谢

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