应用二硫键捕获型单链三聚体技术制备PR1-HLA-A*0201四聚体

摘要

细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic TLymphocytes，CTL)是机体抗肿瘤、抗移植物及有效控制各种感染的重要免疫防御效应细胞，定量检测抗原特异性CTL一直是免疫学界努力目标之一。
　　T细胞是通过TCR识别靶细胞或抗原递呈细胞表面MHC分子结合的特异性表位肽复合体，但这种特异性识别亲和力低，迅速发生解离。MHC-Ⅰ四聚体技术正是基于TCR与抗原肽-MHC-Ⅰ的特异性相互作用，利用生物素-亲和素结合的原理，在体外将MHC-Ⅰ分子及其所递呈的抗原肽组装成抗原肽-MHC-Ⅰ四聚体复合物。MHC-Ⅰ四聚体复合物增强了MHC-Ⅰ分子与T细胞受体的亲和力，借助流式细胞技术可以对结合有抗原肽-MHC-Ⅰ四聚体的T细胞进行检测和分离。但后来发现传统四聚体制备流程复杂，成本高，加之复性效率低，特别是对于与MHC分子低亲和力的抗原肽，极难形成稳定的pMHC-Ⅰ单体，这些缺陷限制了四聚体技术的应用。
　　MHC-Ⅰ单链三聚体技术(single chain trimer，SCT)的出现一举解决了上述问题，它是将抗原肽、β2m和MHC-Ⅰ分子以适当的接头(linker)依次串联而成，只需克隆表达一次，纯化一次，大大简化了制备过程，而且得率较传统四聚体高得多，大大降低了成本。更为重要的是，MHC-Ⅰ SCT可以使抗原肽与MHC分子的结合更加稳定，本质上是增加了一个再结合的过程，是一个补偿效应，这使得四聚体技术的使用范围扩大至某些与MHC分子较低亲和力的抗原肽。但是，如果抗原肽与SCT的抗原结合槽的结合能力低到一定程度，也会有被取代的危险。出于这方面的考虑，我们对SCT进行了改进，引入“二硫键”，使得抗原肽更牢固地锚定在抗原结合槽内。
　　慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种髓系造血干细胞恶性增生性疾病，目前仍缺乏有效的根治方法，过继性细胞免疫治疗成为了理想的方法。PR1为来自CML相关抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽(VLQELNVTV)，其诱导的CTLs可杀伤白血病细胞，但对正常骨髓细胞无毒性。本实验改造的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚体旨在提高PR1特异性CTL的检出率，期望成为CML研究中的有力工具。
　　本研究中，我们首先利用基因工程技术对实验室已有的PR1-HLA-A*0201 SCT融合基因载体进行改造，在PR1肽、β2m及HLA*0201以柔性linker依次串联的基础上，运用SOE-PCR的方法将A2分子的“肽C末端结合区”的第84位氨基酸由酪氨酸(Tyr)突变为半胱氨酸(Cys)，同时在linker1中引入一个Cys，两个半胱氨酸残基形成一个二硫键，使抗原肽C末端更好地锚定，确保抗原肽和抗原结合槽的稳固结合。再将改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT融合基因，克隆到pET22b载体中进行原核表达，通过洗涤包涵体获得大量改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵体蛋白。然后对改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵体蛋白进行纯化、折叠复性、超滤截留，再将其生物素化，根据生物素化效率，按照4.5∶1摩尔比和PE标记的链霉亲和素结合，形成一个标记荧光素的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚体。
　　通过流式检测CML临床标本，发现PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚体在PR1-CTL的检出率上明显优于未改造的PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体，并且治疗后的CML病人体内PR1-CTL的频数要比未经过治疗的病人高，两者存在显著性差异。在对PR1-CTL这群特异性细胞的分析中发现存在CD45RO和ⅠFN-γ阳性细胞。