鸡白痢沙门菌鸡胚感染模型的建立及其减毒突变株的筛选与鉴定

摘要

鸡白痢是一种由鸡白痢沙门菌引起的鸡的常见传染性疾病，不同日龄的鸡均可感染该病。雏鸡感染后表现为急性败血症，发病率和死亡率升高;成年鸡感染后多表现为慢性经过和隐形带菌，因损害生殖系统可严重影响产蛋率、孵化率和雏鸡成活率。此病给养鸡业带来严重危害，造成很大经济损失。现有研究对该病原菌进入机体后持续存在、免疫逃逸以及垂直传播等问题仍然认识不足，需要进一步地研究鸡白痢沙门菌感染与致病机理，以便寻找防治该病的药物和疫苗的新靶点，使该沙门菌得以预防和控制，乃至净化。 转座突变技术是研究致病菌和宿主之间相互作用的一种有效手段，转座子在随机插入到与病原体致病过程有关的毒力基因中之后，会使受体菌的这些插入基因的功能缺失而无法引起持续性感染，结果不能在宿主体内存活下来。运用转座突变技术确定鸡白痢沙门菌在鸡胚感染模型中相关基因，具有非常重要的现实意义，能够为疫苗的研究奠定基础。 本研究首先建立了鸡白痢沙门菌鸡胚感染的模型，然后使用含有标签的pUTmini-Tn5Km2(Cm)(tagF)转座载体构建了鸡白痢沙门菌S06004突变体库进行负向筛选。筛选得到一些突变株，进行了基因定位，并对这些突变株的表型、生长特性和毒力做了进一步的鉴定。 1.鸡白痢沙门菌鸡胚感染模型的建立 为建立鸡白痢沙门菌鸡胚感染模型，对接种方法、接种剂量、接种日龄和细菌在鸡胚中的脏器定植做了分析，最终确定以100 CFU和200 CFU两个感染剂量尿囊腔接种16日龄的鸡胚，待雏鸡孵出后，取其肝脏和脾脏作为筛选突变株的脏器来源。 2.鸡白痢沙门菌减毒突变株的筛选与鉴定 利用STM技术将pUTmini-Tn5Km2(Cm)(tagF)转座载体上含特异性信号标签tagF和抗性基因的转座子随机插入鸡白痢沙门菌基因组中，以相应的抗生素进行筛选，获得大量在细菌基因组不同位点插入转座子的突变体库（100×12=1，200个突变株），再以鸡胚为感染模型筛选突变株，筛选得到15株突变株。通过接头法，扩增出转座子侧翼序列，进行NCBI BLAST比对，通过序列相似性判定突变基因及插入位点。在已经鉴定的11株突变株中，有9株的突变基因功能已知:uvrY∷Tn5，folA∷Tn5，citC∷Tn5，yabF∷Tn5，rfbG∷Tn5，miaA∷Tn5，fisN∷Tn5，wza∷ Tn5，untitled1∷Tn5，有2株的突变基因功能未知:untitled2∷Tn5，untitled3∷Tn5。被插入失活的基因除untitled3∷Tn5位于毒力质粒上，其余10株均在非毒力岛的基因组中，这些基因与细菌的侵袭、繁殖、代谢和防御有关。对突变基因功能已知的9株突变株进行了生化特性和生长特性的测定，结果显示，基因的失活影响了突变株的生化特性，但对其生长特性没有显著影响。体内和体外竞争生长比率表明在体内突变株无法与野生株竞争生长，说明突变株致病能力减弱或不致病。突变株对鸡胚的毒力检测结果表明基因失活后，突变株的毒力都出现不同程度的下降。这些研究结果对理解鸡白痢沙门菌感染与致病机理，寻找防治该病的药物和疫苗的新靶点奠定了重要基础。

目录

摘要

符号说明

文献综述 应用STM挖掘沙门菌功能性基因的研究进展及沙门菌污染鸡蛋的机理

1．沙门菌的致病机理

2．信号标签突变技术

2．1 转座子

2．2 标签序列

2．3 检测方法

2．4 突变基因的鉴定

2．5 功能验证

3．STM在沙门菌中的应用

3．1 STM在鸡白痢沙门菌中的应用

3．2 STM在肠炎沙门菌中的应用

3．3 STM在鼠伤寒沙门菌中的应用

3．4 STM在其余沙门菌中的应用

4．沙门菌污染鸡蛋的机理

4．1 从蛋壳外部污染到鸡蛋内部污染的过程

4．2 在鸡蛋形成期间鸡蛋的污染

4．3 在蛋清和卯黄膜中的抗微生物成分

5．结语

参考文献

第一章 鸡白痢沙门菌鸡胚感染模型的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 鸡白痢沙门菌减毒突变株的筛选与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

致谢

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