不同牧草来源的NDF在瘤胃中降解特性及其对细菌群落结构的影响

摘要

吸附是微生物降解牧草细胞壁的关键，紧密吸附于细胞壁上的微生物数量和群落结构与牧草组成和组织结构密切相关。细胞壁中纤维素、半纤维素和果胶等物质经微生物降解后形成大量挥发性脂肪酸为反刍动物供能，它们对奶牛瘤胃健康和脂肪酸合成至关重要，并能降低奶牛发生瘤胃酸中毒的几率。因此，提高牧草降解率和高效利用牧草资源一直都是动物营养学研究的热点。 本文运用半体内法，借助电子显微镜和高通量测序技术并结合动物生产试验探究不同牧草纤维瘤胃动态降解规律及其对泌乳中期奶牛瘤胃发酵、微生物蛋白合成和瘤胃细菌群落结构的影响。 试验1瘤胃微生物对不同牧草动态降解特性及组织结构变化的研究 本试验旨在研究苜蓿、燕麦草、羊草和稻草茎秆在奶牛瘤胃中的降解特性及组织结构变化。选用长势株高相近的初花期苜蓿、抽穗初期燕麦草和羊草以及稻草秸秆，剥离出茎秆后将样品分为两份，一份用于尼龙袋降解率试验，样品在瘤胃中降解2h、6h、12h、24 h、36h、48 h和72 h取出，测定干物质(DM)和中性洗涤纤维(NDF)降解率;另一份用于扫描和透射电子显微镜观察。结果显示:(1)四种牧草DM降解率随时间的增加不断上升，DM72 h降解率:燕麦草＞苜蓿＞稻草＞羊草，燕麦草分别比苜蓿、稻草和羊草高8.36％、20.83％和53.41％。(2)四种牧草NDF降解率随时间的增加不断上升，NDF72 h降解率:燕麦草＞稻草＞羊草＞苜蓿，燕麦草分别比稻草、羊草和苜蓿高5.43％、11.17％和16.17％。(3)植物细胞壁中非木质化组织在24 h内可被微生物完全降解，但木质部纤维及导管不被降解。瘤胃微生物对苜蓿为内、外双向降解，燕麦草和稻草为由内向外单向降解，羊草在48h前为由内向外的单向降解，但之后为内、外双向降解。(4)球菌、杆菌和不规则形状菌是吸附在纤维表面的主要菌群，细菌种类和数量与组织结构类型密切相关，它们通过靠近、吸附或嵌入的方式降解细胞壁。结果表明:不同牧草茎秆DM和NDF降解率各不相同，细胞壁组分、组织结构和吸附的微生物种类及数量会影响牧草茎秆在瘤胃中的降解率。 试验2吸附在牧草细胞壁中的细菌群落结构研究 本试验探究吸附在不同牧草茎秆内部细菌的群落结构多样性。分别将粉碎后的苜蓿、燕麦草、羊草和稻草茎秆3.0 g放入尼龙袋中，降解24 h全部取出，洗净后提取总DNA，根据高通量测序要求制样。结果显示:(1)吸附在不同牧草细胞壁中的细菌群落结构丰富度:燕麦草＞苜蓿＞稻草＞羊草;细菌群落结构多样性:羊草＞稻草＞燕麦草＞苜蓿。(2)四组牧草样品共鉴定得到16个门，27个纲，37个目，63个科和91个属。门水平上，硬壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门、纤维杆菌门和变形菌门为优势菌门;属水平上，丁酸弧菌属、普雷沃氏菌属、纤维杆菌属和密螺旋体属为优势菌属。(3)相同牧草吸附的细菌群落结构相似，但不同牧草之间差异明显。(4)基于UniFrac的加权主坐标分析其第一主成分和第二主成分的贡献率为52.89％和19.43％，相同牧草样品的细菌遗传距离更接近，不同样品间存在明显差异。(5)苜蓿、燕麦草、羊草和稻草中OTU数目分别为5778、6984、5220和6018，四组牧草共享2913个OTU，占细菌总OTU数目的32.38％。结果表明:不同牧草吸附的细菌种类和数量存在显著差异。 试验3不同牧草来源日粮对奶牛瘤胃发酵、微生物蛋白合成和细菌群落结构的影响 选用8头荷斯坦奶牛（体重632±12 kg;泌乳天数135±16d），采用4×4重复拉丁方设计，以苜蓿、燕麦草、羊草和稻草为粗饲料来源，给奶牛饲喂以玉米青贮为基础、等能等氮且NDF和非纤维性碳水化合物(NFC)含量相同的日粮，研究不同牧草来源日粮对奶牛瘤胃发酵、微生物蛋白合成和细菌群落结构的影响。结果显示:(1)在日粮NDF和NFC含量相同的条件下，不同牧草来源日粮对奶牛瘤胃发酵无显著影响，且苜蓿、燕麦草和稻草组微生物蛋白合成无显著差异。(2)16个瘤胃液样品共鉴定得到16个门，28个纲，42个目，64个科和89个属，拟杆菌门、硬壁菌门、螺旋体门和纤维杆菌门为优势菌门;普雷沃氏菌属、丁酸弧菌属、纤维杆菌属和密螺旋体属为优势菌属。(3)在属水平上，相同牧草饲喂组瘤胃液中细菌相似性更高，苜蓿、燕麦草和稻草组细菌的遗传距离接近。 结果表明:当日粮等能等氮且NDF和NFC含量相同时，可以考虑选择不同牧草饲喂泌乳中期奶牛。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 瘤胃微生物对牧草细胞壁降解的研究进展

1．1 牧草组织及细胞壁结构

1．2 瘤胃中降解植物细胞壁的微生物

1．3 瘤胃微生物对细胞壁的降解

2 分子生物学方法对瘤胃微生物多样性的研究进展

2．1 瘤胃微生物定量分析

2．2 瘤胃微生物多样性指纹图谱技术

2．3 宏基因组学研究

3 牧草来源对奶牛瘤胃发酵、微生物蛋白合成和瘤胃微生物的研究进展

3．1 不同牧草来源日粮对瘤胃发酵的影响

3．2 不同牧草来源日粮对微生物蛋白合成的影响

3．3 不同牧草来源日粮对瘤胃微生物区系的影响

4 本研究目的与意义

第二章 瘤胃微生物对不同牧草动态降解特性及组织结构变化的研究

1 材料与方法

1．1 试验动物和饲养管理

1．2 试验材料

1．3 DM和NDF瘤胃降解率和降解参数

1．4 电镜样品的制备与观察

1．5 数据分析

2 结果与分析

2．1 不同牧草茎秆DM降解率和降解参数

2．2 不同牧草茎秆NDF降解率和降解参数

2．3 苜蓿茎秆组织结构的降解

2．4 燕麦草茎秆组织结构的降解

2．5 羊草茎秆组织结构的降解

2．6 稻草茎秆组织结构的降解

3 讨论

3．1 瘤胃微生物对苜蓿茎秆降解的影响

3．2 瘤胃微生物对燕麦草茎秆降解的影响

3．3 瘤胃微生物对羊草茎秆降解的影响

3．4 瘤胃微生物对稻草茎秆降解的影响

4 小结

第三章 吸附在牧草细胞壁中的细菌群落结构研究

1 材料与设备

1．1 主要试剂和药品

1．2 主要仪器和设备

2 材料与方法

2．1 试验动物和饲养管理

2．2 试验材料

2．3 试验步骤

2．4 牧草中微生物混合总DNA的提取

2．5 PCR扩增及胶回收纯化

2．6 构建文库并测序

3 数据处理与分析

3．1 序列处理

3．2 优质序列的生物信息学处理

3．3 数据统计和分析

4 结果与分析

4．1 细菌丰富度和多样性

4．2 细菌组成和群落结构

4．3 处理组间的相似性分析

5 讨论

6 小结

第四章 不同牧草来源日粮对奶牛瘤胃发酵、微生物蛋白合成和细菌群落结构的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物、日粮及饲养管理

1．2 试验设计

1．3 样品采集与测定

2 统计分析

3 结果与分析

3．1 不同牧草来源日粮对瘤胃发酵的影响

3．2 不同牧草来源日粮对微生物蛋白合成的影响

3．3 不同牧草来源日粮对瘤胃细菌群落结构的影响

4 讨论

4．1 不同牧草来源日粮对瘤胃发酵的影响

4．2 不同牧草来源日粮对微生物蛋白合成的影响

4．3 不同牧草来源日粮对瘤胃细菌群落结构的影响

5 小结

结论、创新点和后续研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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