Hsp90α参与IBDV感染鸡法氏囊细胞及其IBDV结合区的初步研究

摘要

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，以严重免疫抑制和青年鸡死亡率高为主要特征，对世界养禽业带来严重的损失。病毒感染的第一步是病毒与靶细胞受体的结合，因此研究IBDV受体对揭示病毒-细胞相互作用非常关键。热应激蛋白90α(Heat shock protein90α，Hsp90α)是细胞适应株IBDV感染鸡成纤维细胞的受体之一或受体复合物成分，但在野毒株IBDV感染鸡法氏囊细胞中的作用尚不清楚。类弹性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）具有温度敏感可逆相变特性，在低于其相变温度的溶液中呈溶解状态，高于相变温度的溶液中呈凝聚状态，因此可用简单的离心法进行其融合蛋白的分离纯化。本课题组将ELP的相变特性与病毒受体结合特异性相结合，建立的病毒受体结合捕捉技术可用于腺病毒的浓缩、纯化和监测。本研究利用相同原理，将鸡Hsp90α及其cDNA片段与ELP进行融合表达，旨在探明Hsp90α的IBDV结合区，并为建立IBDV浓缩与纯化方法奠定基础。
　　为了初步确定Hsp90α的IBDV结合区，用RT-PCR从鸡胚成纤维细胞扩增Hsp90α全长cDNA及其N端284个氨基酸编码序列和C端444个氨基酸编码序列，分别插入含ELP编码序列的原核表达载体pET-ELP;分别将重组质粒pET-ELP-Hsp90α、pET-ELP-N284和pET-ELP-C444转化BLR(DE3)大肠杆菌，在20℃用IPTG诱导重组蛋白表达，在优化条件下用ELP的温度敏感逆向相变循环(ITC)纯化融合蛋白;将纯化的融合蛋白与IBDV孵育结合，用RT-PCR检测病毒是否与重组Hsp90α及其片段结合。结果显示:ELP与Hsp90α及其片段融合蛋白均为可溶性表达;ELP-Hsp90α和ELP-C444融合蛋白能与IBDV结合，而ELP-N284融合蛋白不能与IBDV结合，表明Hsp90α的IBDV结合区位于C端444个氨基酸区域。
　　为了探明Hsp90α是否参与野毒株IBDV感染鸡法氏囊细胞，从SPF鸡胚分离培养法氏囊细胞，分别用RT-PCR和间接免疫荧光试验检测Hsp90α表达，以法氏囊细胞系DT40细胞和成纤维细胞系DF-1细胞为对照，结果显示法氏囊细胞系及原代细胞均表达Hsp90α分子;分别用重组Hsp90α孵育IBDV和Hsp90α抗体孵育法氏囊细胞，间接免疫荧光试验和病毒滴定检测结果显示重组Hsp90α及其抗体对IBDV感染法氏囊细胞均有部分阻断作用，其中Hsp90α抗体的阻断作用较强，与鸡sIgM抗体的阻断作用接近，提示Hsp90α参与强毒株IBDV感染法氏囊细胞，但与sIgM一样，不是IBDV感染法氏囊细胞的唯一受体。

目录

摘要

符号说明

综述

1 传染性法氏囊病病毒研究进展

2 热应激蛋白90研究进展

3 病毒受体研究进展

研究内容一：Hsp90α蛋白IBDV结合区的初步确定

1 材料

1．1 菌株、毒株、细胞及载体

1．2 工具酶及主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 培养基

1．5 常用溶液

2 方法

2．1 基因克隆

2．2 表达载体构建

2．3 重组蛋白诱导表达

2．4 重组蛋白表达分析

2．5 重组蛋白的纯化

2．6 重组蛋白的鉴定

2．7 Hsp90α蛋白IBDV结合区鉴定

3 结果

3．1 Hsp90α全长cDNA扩增

3．2 Hsp90α基因片段扩增

3．3 重组载体鉴定

3．4 表达载体的鉴定

3．5 重组蛋白表达分析

3．6 重组蛋白纯化

3．7 重组蛋白的鉴定

3．8 Hsp90α蛋白IBDV结合区鉴定

4 讨论

研究内容二：Hsp90α参与IBDV感染法氏囊细胞的初步研究

1 材料

1．1 细胞和实验动物

1．2 主要试剂

1．3 培养基

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 鸡法氏囊细胞制备

2．2 RT-PCR检测

2．3 间接免疫荧光试验

2．4 IBDV感染阻断试验

3 结果

3．1 Hsp90α基因转录检测

3．2 Hsp90α蛋白表达检测

3．3 重组Hsp90α的病毒感染阻断作用

3．4 抗体的病毒感染阻断作用

4 讨论

参考文献

致谢

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