猪等孢球虫的分离鉴定及其防治药物的效力试验

摘要

猪球虫病是由猪等孢球虫（Isospora suis）和某些艾美耳属（Eimeria）球虫寄生于仔猪小肠上皮细胞内引起的一种以腹泻为主要特征的寄生性原虫病，呈世界性分布。在欧美国家，猪等孢球虫是引起7～14日龄仔猪腹泻的主要病原。猪等孢球虫病的临床症状与其他病原引起的仔猪腹泻很相似，在诊治上易产生误诊。由于球虫具有严格的宿主特异性，因此对猪球虫病的研究只能以猪作为模型动物。然而，用猪作为模型动物的试验研究管理难度较大，同时猪球虫的繁殖率又较低以及哺乳动物球虫的人工感染试验研究的不确定性，所以对猪球虫病的研究相对较少。目前，猪等孢球虫病的防治多选用磺胺类药物，但其治疗效果不确定;在传统分类上，猪等孢球虫隶属艾美耳科(Eimeriidae)、等孢球虫属（Isospora），但随着对其他哺乳动物等孢球虫的生活史研究，认为哺乳动物的等孢球虫为成囊类球虫，与鸟类的等孢球虫不同。为此，本文就猪等孢球虫的生物学特性及其种系发育关系进行了研究与分析，并通过人工感染试验评价了妥曲珠利对猪等孢球虫病的效力，为猪等孢球虫病的防治提供理论与实验依据，也为猪等孢球虫的分类位置提供依据。
　　1.猪等孢球虫纯种株的分离鉴定及其生物学特性的研究
　　为了了解猪等孢球虫的生物学特性和排卵囊规律，对纯种卵囊进行分离与鉴定后，分别用4×102个和1×104个猪等孢球虫孢子化卵囊感染24日龄无球虫感染的仔猪，感染后观察猪的临床症状及球虫的潜隐期、显露期和排卵囊量。结果显示，仔猪感染4×102个卵囊后未出现明显的临床症状，感染1×104个卵囊后第6天出现明显的临床症状，主要表现为精神沉郁，食欲不振，皮肤灰白，排灰色的稀粪。感染后第12d症状好转。仔猪感染4×102个与1×104个卵囊的排卵囊规律基本相似，潜隐期均为5d，显露期分别为7d和18d，排卵囊高峰期分别是在感染后第7～10 d和第7～12 d。感染4×102个孢子化卵囊时每头猪的排卵囊总数为1.27×106个，感染1×104个孢子化卵囊时每头猪的排卵囊总数分别为6.47×106、6.37×106个。结果表明本文建立的猪等孢球虫虫株（命名为猪等孢球虫扬州株）对仔猪有致病性，可用于猪球虫病的研究。
　　2.猪等孢球虫扬州株18S rRNA基因的克隆与系统发育分析
　　为了从分子水平上证实本文建立的等孢球虫虫株确实是猪等孢球虫，并探讨猪等孢球虫扬州株与其他球虫间的亲缘关系，首先通过PCR扩增、DNA片段的克隆及测序，获得猪等孢球虫扬州株的18S rRNA序列;然后比较该序列与GenBank中猪等孢球虫及相近种属原虫18S rRNA基因间的同源性，并构建系统发育进化树。结果显示，猪等孢球虫扬州株的18S rRNA序列与另一株猪等孢球虫的同源性为99.8％，与其他哺乳动物等孢属球虫的同源性也都在98％以上;猪等孢球虫与弓形虫属、新孢子虫属等成囊类原虫构成一个姊妹群，两者构成一个分支后又同住肉孢子虫属原虫形成姊妹群;而艾美耳属球虫与鸟类等孢属球虫间的亲缘关系较近，两者形成一个分支后与前者间形成姊妹群。
　　3.猪等孢球虫扬州株ITS区序列的克隆与系统发育分析
　　为了进一步探讨猪等孢球虫的分类位置，对猪等孢球虫扬州株的ITS区序列进行PCR扩增、克隆并测序，将得到的ITS序列与GenBank中猪等孢球虫及相近种属原虫ITS区基因序列进行同源性比较，并构建系统发育进化树。结果显示:猪等孢球虫的ITS区基因序列与其他成囊类等孢球虫同源性较高为88.3％～91.6％，与弓形虫、新孢子虫的同源性为51.0％～51.5％，与哈蒙德虫的同源性为45.8％～49.2％，与禽源的鸡艾美耳球虫的同源性为43.4％～48.0％;将得到的ITS-1序列与GenBank上等孢属序列进行比对分析发现，猪等孢球虫扬州株的ITS-1序列与猪等孢球虫(EU124685)的同源性为99.0％，与其他等孢属球虫的同源性为74.5％～94.5％，与弓形虫的同源性为32.6％～35.3％。结论:与以18SrRNA基因为分子标记的分类结果相同，在分子水平上哺乳动物等孢球虫属于肉孢子虫科，鸟类等孢球虫属于艾美耳科。
　　4.妥曲珠利触变型混悬液对哺乳仔猪等孢球虫病的疗效试验
　　为了评价妥曲珠利触变型混悬液对仔猪等孢球虫病的治疗效果，将新出生的6窝仔猪随机设为妥曲珠利触变型混悬液高剂量组(40 mg/kg)、中剂量组（20 mg/kg）和低剂量组（10 mg/kg）、妥曲珠利混悬液对照组(20 mg/kg)、阳性对照组和阴性对照组。出生后第4天感染猪等孢球虫扬州株10000个孢子化卵囊，第6d按设计及规定剂量经口一次给药，随后分别从临床症状、粪便粘度与腹泻率、排卵囊数与卵囊减少率、仔猪体重变化以及组织病理学等参数来评价药效。试验重复一次。试验结果:妥曲珠利触变型混悬液高剂量药物组、中剂量药物组、百球清、阴性组在试验过程中未出现腹泻，在粪便中也没有检测到卵囊排出，4个组组间增重差异不显著;而低剂量组在试验过程中出现轻微腹泻，并有少量卵囊排出。而阳性组病变明显，排出大量卵囊，增重与阴性组比较差异显著(P＜0.05)。结论:妥曲珠利触变型混悬液和百球清对猪等孢球虫有良好的疗效，妥曲珠利触变型混悬液的临床推荐剂量为20 mg/kg，一次口服。

目录

摘要

符号说明

文献综述

一、猪球虫病的研究进展

二、18S rRNA和ITS基因序列在寄生虫分类鉴定及系统发育中应用的研究进展

第一章 猪等孢球虫纯种株的分离鉴定及其生物学特性的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 猪等孢球虫扬州株18S rRNA基因的克隆与系统发育分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 猪等孢球虫扬州株ITS区序列的克隆与系统发育分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 妥曲珠利触变型混悬液对哺乳仔猪等孢球虫病的疗效试验

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

声明