部分禽类mtDNA序列测定及在不同来源禽肉鉴定上的应用

摘要

目前市场上肉类品种混杂，掺杂掺假、以次充好的现象屡禁不止。针对这些现象，亟需建立一种快速的检测技术。线粒体基因组(mtDNA)具有多态性丰富、无重组、母系遗传等特点，是开展系统发育学、分子生态学、分类学等研究的理想分子标记。我国家禽品种众多，某一家禽品种难以代表本物种的遗传特征，本研究以线粒体基因作为目标基因，在获取鸿雁(Anas poecilorhyncha，中国鹅种的祖先)和斑嘴鸭(Anas po ecilorhyncha，家鸭祖先之一)线粒体全序列基础上，选取细胞色素氧化酶基因Ⅰ(COⅠ)作为目标基因，对6种具显著代表性的家禽肉（鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和鸽）线粒体DNA基因条形码区域进行扩增与鉴定，通过序列比对等方法建立了一种快速鉴别禽肉的分子生物学方法。主要研究结果如下:
　　通过对斑嘴鸭线粒体基因组全序列的扩增，获得了斑嘴鸭线粒体全序列16606bp，并提交Genbank(AccessionNo.KF751616)，其包含22个tRNA、2个rRNA基因、13种蛋白质编码基因和1个D-loop区。碱基组成T为22.2％，C为32.8％，A为29.2％，G为15.8％，无明显的AT偏好性，22种tRNA都为典型的三叶草结构，参照棕头鸦（Larus brunnicephalus）和黑尾地鸦（Podoces hendersoni）的12S rRNA，对斑嘴鸭12S rRNA的二级结构进行了预测，含有4个结构域和37个茎环。对D-loop控制区序列分析发现其含有goose hairpin，E-box，F-box，D-box，Bird similarity-box及CSBl-box。以原鸡作为参考群体，采用NJ算法和ML算法，基于线粒体基因组全序列及D-loop区（鸭属4个种，家鸭3个种，原鸡）分别构建系统进化树，发现3个家鸭品种与绿头鸭亲源关系较近。
　　通过同样的方法，我们获得了鸿雁16739 bp的线粒体全序列，并提交GenBank(AccessionNo.KJ124555)，其包含22个tRNA、2个rRNA基因、13种蛋白质编码基因和一个D-loop区。碱基组成T为22.49％，C为32.24％，A为30.21％，G为15.06％，无明显的AT偏好性。22种tRNA都为典型的三叶草结构，参照原鸡（Gallus gallus）和黑尾地鸦（Podoces hendersoni）的12S rRNA，对鸿雁12S rRNA的二级结构进行了预测，发现其含有4个结构域、37个茎环和13个突出部。对D-loop控制区序列分析发现，含有LSP/HSP、ETASl-2、Goose hairpin、E-box、F-box、D-box、C-box、Bird similarity-box、CSBl-box、CSB-like和OH。同样以原鸡作为参考群体，采用邻接法(NJ)、最大拟然法(ML)算法和贝叶斯法，基于线粒体基因组全序列分别构建系统进化树，发现鸿雁与灰雁(Anser anser)、豆雁（Anser fabalis）、白额（Anser albifrons）和加拿大黑雁（Branta canadensis）处于一个分支，亲缘关系较近。
　　通过对鸡雁小纲（Galloanserae）线粒体基因组全序列进行分析，筛选出COI基因上游基因条形码区域作为候选目标区域，并针对其两端保守区域设计禽类通用引物(P4)，并以发表的鸟类COI通用引物(P8)为对照，以鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和鸽六种禽肉为实验材料，采用PCR-RFLP对6种不同来源禽肉的COI条形码区域进行了扩增与鉴定，试验结果显示，6种禽类在P4通用引物扩增的酶切产物中均呈现出不同的条带组合，P8通用引物可扩增出不同的条带组合，由此可见，P4和P8两种COI条形码通用引物都可实现对6不同禽肉准确的鉴定。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 肉类掺假鉴定的必要性

2 肉类鉴定技术

2．1 以蛋白质检测为基础的鉴定方法

2．2 以核酸分子检测为基础的鉴定技术

2．3 物种定量鉴定

3 线粒体基因组研究进展

3．1 线粒体DNA结构特点

3．2 线粒体DNA特殊复制方式

3．3 线粒体基因组研究方法

3．4 鸟类线粒体DNA的研究现状

4 DNA条形码研究进展

4．1 DNA条形码技术的原理

4．2 DNA条形码的基本要求

4．3 DNA条形码的应用

5 鸡雁小纲系统分类学地位

6 本研究的目的和意义

第二章 试验部分

实验一 斑嘴鸭线粒体基因组全序列测定与系统发生分析

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

实验二 鸿雁线粒体基因组全序列测定与系统发生分析

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

实验三 不同禽肉的COI序列条形码区域扩增与RFLP鉴定

前言

1、材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明