两步快速纯化鸡产蛋下降综合症病毒方法的研究及标准抗原、标准血清的制备

摘要

鸡产蛋下降综合症（Egg Drop Syndrome-76，简称EDS-76）是由腺病毒感染引起种鸡和蛋鸡产蛋量急剧下降，同时伴有无壳蛋、薄壳蛋、软壳蛋、畸形蛋的一种病毒性疾病。该病是世界范围内导致鸡产蛋率下降的重要原因之一。本研究在蔗糖密度梯度离心的基础上建立了一种快速纯化EDSV的新方法，制备了一批EDS-76抗鸡血清，以此为生物学材料，进一步标定EDS-76的抗原和抗血清，获得了标准抗原和标准阳性血清，为EDSV的诊断和防治提供了有效的方法和材料。
　　1.鸡产蛋下降综合症病毒纯化方法的研究
　　本研究将传统的蔗糖密度梯度离心与两步法快速纯化方法进行了比对分析。电镜比对结果显示:新建立的两步法快速纯化方法可以得到大量形态大小一致的球形病毒粒子，直径70～80nm，符合腺病毒粒子的典型特征;而传统纯化方法得到的病毒粒子则数量稀少，壳粒边缘有缺损，形态模糊。血凝性试验比对结果显示:传统方法得到的病毒HA效价为216，而新建立的两步法快速纯化方法得到的病毒HA效价为219，血凝效价较高。PCR鉴定结果显示:用引物Ⅰ、Ⅱ分别进行PCR扩增，发现两种纯化方法得到的病毒均可扩增出大小为918bp及2733bp的两条特异性条带。综合分析提示:新建立的两步法纯化方法比起传统方法更加省时省力，且病毒纯化效果更加显著，这为后期标准抗原的制备奠定了基础。
　　2.鸡产蛋下降综合症标准抗原的制备
　　将纯化的病毒抗原进行了PCR纯异性分析、Western-blot反应谱分析、琼扩试验分析以及病毒灭活条件测定。结果表明本研究纯化的病毒无CAV、REV、ALV、MDV、IBV、GPV、IBDV、ILTV等外源性病毒，无菌检验、支原体检验合格，具有很高的纯粹性，且该病毒与经典AV-127种毒具有相同的Western-blot反应谱，同时该病毒还可以用于琼扩试验诊断。用甲醛和β-丙内酯分别灭活该纯化病毒，制备标准抗原，并进行比较，最后确定灭活条件为0.5％β-丙内酯作用60h。
　　将纯化的病毒用PBS缓冲液稀释至效价为214，按上述灭活条件对病毒进行灭活，加入1％BSA保护剂，分装，冻干。对抗原的质量进行验证，同时检查物理性状、均一性、稳定性、保质期等进行鉴定，最后获得了高质量的标准抗原。
　　3.鸡产蛋下降综合症标准血清的制备
　　采取自然感染的途径对SPF鸡进行攻毒，6免之后制得效价为215的抗鸡血清。在EDSV感染的CEF上进行IFA效价检测，血清的IFA效价达1∶1000。特异性鉴定发现该血清不与NDV、AIV、ALV-J、ALV-A、GPV、REV、MDV、IBV、CAV、TMUV、REOV等外源病毒反应，而只与EDSV反应。将制备的多抗血清，加入0.01％硫柳汞，分装，冻干。测净重，计算并分析分装差异系数CV值，并进行物理性状的检查以及无菌检验、支原体检验、均一性、稳定性、保质期等特性的鉴定，最终获得了性能良好的标准血清。

目录

摘要

符号说明

文献综述

综述一 产蛋下降综合症的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 临床症状

4 病理学变化

5 发病机理

6 实验室诊断技术

7 防制措施

综述二 标准物质的研究进展

1 标准物质的研究进展

2 标准物质的制备要求

研究一 鸡产蛋下降综合症病毒纯化方法的研究

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂

2 方法

2．1 病毒扩增

2．2 HA效价测定

2．3 病毒纯化

2．4 病毒纯化效果对比

3 结果

3．1 病毒扩增及纯化

3．2 病毒纯化效果对比

4 讨论与小结

研究二 鸡产蛋下降综合症抗原标准物质的制备

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂

2 方法

3 结果

4 讨论与小结

研究三 抗鸡产蛋下降综合症血清标准物质的制备

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂

2 方法

2．1 鸡产蛋下降综合症多抗血清的制备

2．2 多抗血清的特性分析

2．3 鸡产蛋下降综合症阳性血清标准物质的制备

3 结果

3．1 鸡产蛋下降综合症多抗血清的制备

3．2 多抗血清的特性分析

3．3 鸡产蛋下降综合症阳性血清标准物质的制备

4 讨论与小结

全文总结

参考文献

致谢

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