家禽养殖过程中弯曲菌的定量跟踪调查及其分子流行病学研究

摘要

弯曲菌是引起人类细菌性胃肠炎最常见的病原菌之一，与沙门菌、志贺菌并列为人类三大腹泻致病菌。禽类是弯曲菌最常见的宿主，且感染弯曲菌后无任何临床症状，但可持续向外界排菌，很容易造成屠宰、加工、零售环节禽肉及其产品的污染。据欧洲食品安全局报告，在肉鸡初级生产阶段控制弯曲菌可预防其大批量地进入屠宰场，进而使得鸡肉产品中不含或仅含少量的弯曲菌，减少人们暴露于这种病原的风险。
　　充分认知家禽养殖过程中弯曲菌感染的生态传播规律，是预防和控制弯曲菌污染的必要前提。虽然各国对不同宿主及食品中弯曲菌的污染状况开展了较为系统的研究，但对家禽养殖过程中弯曲菌的流行病学研究还相对匮乏。本研究选择规模化鸡场的鸡群，在其养殖过程中进行弯曲菌的定点、定性、定量跟踪调查，探究养殖过程中弯曲菌的流行规律;同时利用PFGE分子分型方法对弯曲菌分离株进行分型分析，以期探明养殖过程中弯曲菌感染与传播的生态规律;并检测其耐药情况及毒力相关基因的分布，为家禽日常饲养管理及弯曲菌的防控提供有价值的指导。
　　一、家禽养殖过程中弯曲菌的定量跟踪流行病学研究
　　选取规模化鸡场的鸡群，在其养殖过程中选择30只鸡进行定点跟踪采样，同时采集鸡舍内外的环境样品。使用平板计数方法和分子生物学鉴定方法，分别对鸡群及环境中的弯曲菌进行检测，并定量分析弯曲菌的污染水平。
　　检测结果表明，鸡群在3周龄后逐渐出现弯曲菌感染，感染率和带菌量在接下来的几天均迅速上升并达到峰值，之后又有所下降。感染率最高可达100％，泄殖腔棉拭子的带菌量在103-107 CFU/g左右。在养殖过程中，家禽体内一直携带弯曲菌，且空肠弯曲菌的分离率高于结肠弯曲菌;空肠弯曲菌和结肠弯曲菌混合感染的比例也较高，达14.4％。环境样品中，污水中弯曲菌的分离率最高(15.8％)，且分离株通常为结肠弯曲菌。不同日龄肉鸡体内各组织弯曲菌的定量检测结果显示，盲肠是弯曲菌的主要定植部位，且带菌量最高达2.55×108 CFU/g。定性及定量结果显示，家禽养殖过程中弯曲菌一旦定植便迅速传播至整个鸡群，且伴随着高感染率，带菌量也较高，对屠宰、加工及零售环节鸡肉及其产品构成了严重威胁，控制家禽养殖环节弯曲菌的带菌量迫在眉睫。
　　二、基于PFGE的家禽养殖过程中弯曲菌传播生态规律分析
　　利用PFGE对不同鸡群养殖过程中不同周龄的365株弯曲菌分离株进行分型实验，根据菌株间相似性系数（F值）大于0.75视为同一谱型菌株来对每个鸡群的弯曲菌分离株的PFGE分型结果进行分析。
　　结果表明，草鸡、BB、FF、J-、J+、JJ、白鸡这7个鸡群非定点鸡不同周龄弯曲菌分离株的PFGE谱型数从7-25不等，鸡群1定点鸡不同周龄的164株分离株分为79个PFGE谱型，且每只鸡体内的弯曲菌分离株也分为6-10个PFGE谱型;另外，草鸡鸡群中同一周龄的弯曲菌分离株具有不同的PFGE谱型（PF1、PF8、PF15等均有8周龄的分离株），不同周龄的分离株具有相同的PFGE谱型（PF4、PF8、PF9等），表明养殖过程中弯曲菌基因组的多样性与保守性。鸡群1定点鸡同一周龄弯曲菌分离株的分型结果显示，不同周龄弯曲菌分离株的PFGE谱型数从6到21不等，与鸡群年龄和分离菌株数目有一定的相关性。环境样品中，污水、苍蝇、鞋底擦拭、地面擦拭、饲料、饮水、垫料和土壤中的部分弯曲菌分离株和鸡源弯曲菌分离株具有相同的PFGE谱型，表明环境中存在的弯曲菌是鸡群感染的来源;此外，环境源弯曲菌分离株含有多个PFGE谱型，可能是鸡体内弯曲菌基因多样性的原因之一。
　　鸡源和各种环境样品弯曲菌分离株之间的遗传关系分析显示，同一PFGE谱型包含不同来源弯曲菌分离株，表明在养殖场环境源弯曲菌是鸡群感染的重要来源。分子分型研究表明，PFGE可作为研究弯曲菌感染、传播和种群结构的有力工具。
　　三、家禽养殖过程中弯曲菌分离株药敏特性及毒力基因分布分析
　　165株不同周龄弯曲菌分离株对21种抗生素的耐药性分析显示，高度耐药的是:青霉素G、头孢克罗、诺氟沙星、环丙沙星、左旋氧氟沙星、萘啶酸、复方新诺明、四环素，高度敏感的是:阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南。耐药菌株的多重耐药分布于8耐到18耐，其中8耐到15耐最多，达86.05％。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对于部分抗生素的耐药率存在较大的差异(p＜0.01)，且结肠弯曲菌耐药性和多重耐药现象更为严重。不同周龄鸡源分离株的耐药特性分析显示，随着周龄的增大，青霉素G、喹诺酮类、磺胺类、四环素类等抗生素总体耐药平稳，头孢菌素类抗生素的耐药率随着周龄的增大而增大，而青霉素类、氨基糖甙类、大环内酯类、林可霉素类等抗生素在7周龄、9周龄、11周龄时的耐药率显著高于其他周龄(p＜0.05);此外，不同周龄弯曲菌分离株的多重耐药状况也存在变化:7周龄、9周龄、11周龄时耐药菌株的多重耐药主要集中在12耐至18耐，而其他周龄耐药菌株的多重耐药主要集中在8耐至12耐。
　　95株不同周龄弯曲菌分离株毒力相关基因分析显示，黏附相关基因中flaA和cadF的阳性率较高，分别为91.58％和95.79％;定植因子中阳性率较高的是racR(90.53％);入侵相关基因中阳性率均小于60％;脂寡糖合成相关基因中阳性率较高的是neuB1(80％);外毒素相关基因中cdtB的阳性率比cdtA、cdtC高，为55.79％。27个毒力基因的阳性检出率随周龄的变化而变化，peb1A、wlaN和neuB1的检出率随着年龄的增大而增大，多达19个基因(flaA、cadF、peb4、galE、waaF、racR、fliG、cheY、rpoN、fliA、docA、flgK、imaA、pldA、flaC、ciaB、cdtB、cdtC和hipO)的检出率变化趋势为先降低又上升。药敏特性及毒力基因分布分析为弯曲菌的防控及致病机理研究提供了重要信息。

目录

摘要

符号说明

综述 家禽养殖过程中弯曲菌的流行病学研究进展

1 家禽养殖过程中弯曲菌的流行现状

1．1 国外流行现状

1．2 国内流行现状

2 家禽养殖过程中弯曲菌的感染与传播

2．1 易感动物

2．2 传染源

2．3 传播途径

3 弯曲菌流行的分子溯源技术研究

3．1 限制酶片段长度多态性(RFLP)

3．2 多位点序列分型(MLST)

3．3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

4 展望

参考文献

第一章 家禽养殖过程中弯曲菌的定量跟踪流行病学研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 家禽养殖过程中弯曲菌流行的定性分析

2．2 家禽养殖过程中弯曲菌流行的定量分析

2．3 不同日龄肉鸡体内弯曲菌的组织分布分析

3 讨论

参考文献

第二章 基于PFGE的家禽养殖过程中弯曲菌传播生态规律分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 鸡群中非定点鸡不同周龄弯曲菌分离株的PFGE分型结果

2．2 鸡群中定点鸡不同周龄弯曲菌分离株的PFGE分型结果

3 讨论

参考文献

第三章 家禽养殖过程中弯曲菌分离株的耐药特性及毒力基因分布分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计学分析

2 结果

2．1 弯曲菌分离株的耐药特性分析

2．2 弯曲菌分离株的毒力基因分布分析

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢

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