针对禽流感N5、N8、N9三种神经氨酸酶NA蛋白单克隆抗体及N5胶体金试纸条的研制

摘要

禽流感病毒(Avian Influenza Viruses，AIVs)属于正黏病毒科中的A型流感病毒属。1996年H5N1亚型高致病性AIVs(Highly pathogenic avian influenza viruses，HPAIVs)首次在我国广东发病的鹅群中分离到。截至2015年，H5亚型AIVs HA基因已经进化出多个不同的分支。值得注意的是，直到2015年底，在clade2.3.4.4分支中，我国已报道分离到多种不同的NA亚型(包括N2、N3、N5、N6、N8) H5亚型重组HPAIVs。除了H5亚型病毒，2013年初，在我国华东地区出现H7N9新型重组病毒感染人的事件，至今仍在不断感染人，引起高达39％的死亡率。遗传进化分析表明H7N9 AIVs是通过H7亚型病毒、N9亚型病毒、和流行于我国鸡群中H9N2亚型AIVs的基因重组产生。这些新型的重组病毒不仅给我国养禽业造成巨大损失，而且对我们人类构成巨大威胁。更重要的是，根据流行病学监测数据分析表明这些新型重组病毒在我国家禽中广泛存在，并还在家禽中不断发生变异。
　　目前，对于AIVs的诊断主要有病毒分离、血凝和血凝抑制、ELISA、RT-PCR等，但这些方法都难以满足操作简易、快速诊断的要求。因此，本研究选取2013～2014年本室分离到的AIVs H5N5亚型毒株A/duck/EastemChina/031/2009(简称031)、H5N8亚型毒株A/duck/ Shandong/Q5/2013(简称QD5)和H7N9亚型毒株A/Chinken/jiaxin/JX148/2014(简称JX148)作为研究对象，制备出针对NA蛋白不同抗原表位的单克隆抗体(McAb)，并进行胶体金试纸条的研制，为AIVs疫情监测及诊断方法的建立提供技术支撑。
　　1.禽流感N5、N8、N9亚型NA蛋白真核表达载体的构建及鉴定
　　将H5N5(031)、H5N8(QD5)和H7N9(JX148)三种不同NA亚型的毒株分别接种9-10日龄SPF鸡胚，35℃条件下孵化。一方面，通过蔗糖密度梯度离心法将收集的病毒尿囊液进行浓缩，用甲醛进行灭活，得到纯化的全病毒免疫原。另一方面，通过重组DNA技术，将不同亚型的NA基因片段分别连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建了真核表达质粒pcDNA3.1-N5、pcDNA3.1-N8、pcDNA3.1-N9，经过酶切和测序鉴定均正确，将真核表达质粒瞬时转染MDCK和293T混合细胞，通过间接免疫荧光鉴定真核表达质粒可以成功表达NA蛋白。
　　2.禽流感N5、N8、N9亚型NA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
　　将纯化好的全病毒与免疫佐剂混合免疫8周龄BALB/C小鼠后，取被免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。利用间接免疫荧光(IFA)方法筛选阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法进行多次亚克隆，获得了8株可稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。其中3株针对H5N8-N8、3株针对于H5N5-N5和2株针对H7N9-N9蛋白。随后对这8株McAb分别进行了腹水效价、抗体亚型、抗体特异性的测定。结果显示:3株来自H5N8(QD5)分别命名为B8C10-5、E8和C10-3，腹水效价依次为1∶105、1∶106、1∶106，抗体亚类依次为IgM、IgM、IgA;3株来自于H5N5(031)分别命名为24、10-5、C6，腹水效价依次为1∶105、1∶106、1∶106，抗体亚类依次为IgG2b、IgG1、IgG2b;2株来自于H7N9(JX148)分别命名为4-B3-C5、C1-B3-4，腹水效价依次为1∶105、1∶107，抗体亚类依次为IgM和IgA。IFA结果显示:除来自H5N5(QD5)的腹水C6没有特异性的荧光，其余的都是阳性。抗体特异性反应实验结果表明，除C10-3(H5N8)与10-5(H5N5)外，其余六株单克隆抗体均与H5N2、H6N2、H3N2、H11N2、H10N3、H5N1、H1N1AIVs无交叉反应。叠加试验表明:除B8C10-5和E8这两株单抗对H5N8抗原识别位点相同外，其余C10-3、24、10-5、C6、4-B3-C5、C1-B3-4六株单抗都识别不同的抗原位点。
　　3.禽流感N5亚型单克隆抗体胶体金试纸条的研制
　　基于以上内容，我们选取了两株配对系数较高，抗体亚型为IgG2b的24(H5N5)和C6(H5N5)腹水进行纯化。以金颗粒标记禽流感N5亚型NA单克隆抗体作为示踪物，用固定在检测线上的山羊抗鼠二抗作为捕获抗体，采用胶体金免疫层析技术，成功研制了能够检测禽流感N5亚型抗原的胶体金试纸条。当用制成的N5亚型胶体金试纸条检测已知禽流感H5N5亚型标准血凝抗原时，检测线出现明显的红色条带，而其它亚型的AIVs包括H5N1、 H3N2、H10N3、H7N9等均呈阴性反应。敏感性试验结果也表明，胶体金试纸条的灵敏度要高于ELISA试验结果，而且操作方便。研制的N5亚型胶体金试纸条具备良好的临床应用价值。

目录

摘要

符号说明

综述 禽流感NA蛋白的功能及流感病毒检测方法研究现状

1．禽流感病毒分子概述

1．1 禽流感病毒的分子结构

1．2 禽流感病毒神经氨酸酶(NA)

2．禽流感病毒的抗原变异

3．禽流感的传播方式

4．禽流感病毒的检测方法

4．1 病原学诊断

4．2 血清学诊断

4．3 免疫荧光实验

4．4 间接酶联免疫吸附(ELISA)试验

4．5 免疫胶体金层析法(GICA)

5．单克隆抗体的研究进展

6．单克隆抗体在禽流感病毒研究和诊断中的应用

6．1 在NA蛋白研究中的应用

6．2 在临床诊断中的应用

7．研究的目的和意义

第一章 禽流感N5、N8、N9亚型NA蛋白真核表达载体的构建及鉴定

1．引言

2．材料

2．1 毒株、鸡胚及鼠抗AIV多抗血清

2．2 细胞系、实验动物

2．3 主要试剂

2．4 溶液的配制

2．5 主要仪器

3 实验方法

3．1 全病毒免疫原的制备及免疫小鼠

3．2 重组质粒PcDNA3．1-NA的构建及质粒表达鉴定

4．试验结果

4．1 双酶切产物鉴定

4．2 间接免疫荧光鉴定

5．讨论

6．结论

第二章 禽流感N5、N8、N9亚型NA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1．引言

2．材料

2．1 质粒、病毒

2．2 细胞、实验动物

2．3 试剂

2．4 主要仪器

3．实验方法

3．1 抗NA蛋白McAb制备

3．2 间接免疫荧光试验(IFA)

4．试验结果

4．1 单克隆抗体细胞株的建立

4．2 测定抗NA单克隆抗体效价和亚类鉴定结果

4．3 单抗排谱结果

4．4 抗体的抗原位点的测定

4．5 间接免疫荧光试验(IFA)结果

5 讨论

6 结论

第三章 禽流感N5亚型McAb胶体金试纸条研制

1．引言

2．材料

2．1 抗体和抗原

2．2 主要试剂

2．3 主要耗材及仪器

2．4 试剂的配制

3．实验方法

3．1 胶体金的制备

3．2 金标Ab最佳稀释度的选择

3．3 单抗包被浓度的确定

3．4 羊抗鼠二抗包被浓度的确定

3．5 金标记免疫层析试纸条的制备

3．6 胶体金免疫层析试纸条结果判定标准

3．7 胶体金试纸条敏感性、特异性、广谱性的检测

4．试验结果

4．1 金标抗体最佳稀释浓度、单抗包被浓度、羊抗鼠二抗最佳浓度

4．2 敏感性试验

4．3 特异性试验

4．4 广谱性检测

5．讨论

6．结论

参考文献

全文总结

致谢

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