空肠弯曲菌噬菌体的分离鉴定及其初步应用

摘要

空肠弯曲菌是革兰氏阴性微需氧细菌，是引起人类肠道疾病最常见的病原菌之一。近年来，由于抗生素的滥用，空肠弯曲菌对抗生素的耐药性一直在持续增强。世界卫生组织已将空肠弯曲菌列为重要的抗生素耐药细菌，迫切需求新型抗菌制剂。噬菌体是一种细菌病毒，它可以特异性识别并感染宿主细菌，在其体内大量复制，最终裂解杀死宿主菌。与抗生素相比，噬菌体产品具有使用简便、特异性强、增殖迅速、抗菌能力强等许多优点。
　　本研究从鸡粪便和污水样品中分离筛选空肠弯曲菌噬菌体，鉴定噬菌体基础生物学特性和基因组特性。并探索空肠弯曲菌噬菌体最佳应用条件，初步评价噬菌体对空肠弯曲菌的消减效果。
　　一、空肠弯曲菌噬菌体的分离和筛选
　　以空肠弯曲菌NCTC11168为宿主菌，采用双层平板法，从1480份鸡粪便样品和污水样品中检测出244份阳性样品，其中粪便样品阳性率19.69％(189/960)，污水样品阳性率10.58％(55/520)。经过筛选和纯化后，获得45株宽裂解谱空肠弯曲菌噬菌体。不同样品中噬菌体分离率和裂解谱差异明显，粪便样品(19.69％)噬菌体分离率高于污水样品(10.58％)，但污水源噬菌体裂解能力强于粪便源噬菌体;活禽市场鸡粪便中的噬菌体分离率最高(43.46％)，中小型肉鸡养殖厂鸡粪便中的噬菌体裂解能力最强;平养模式养殖的鸡粪便中的噬菌体分离率(36.74％)和噬菌体裂解能力均高于笼养(2.00％)和散养(7.00％)模式。裂解谱测定显示，45株噬菌体对于90株空肠弯曲菌分离株展现出了较强的裂解能力，其中对鸡源、人源、牛源空肠弯曲菌的裂解率分别为60.71％(34/56)、76.19％(16/21)、75.00％(6/8)。进一步分析裂解谱数据后，筛选出9株裂解谱不同的噬菌体CP7，CP13，CP15、CP23、CP32、CP33、CP35、CP39和CP47，其中CP39裂解率最高(53.33％)，CP47裂解率最低(32.22％)，CP7裂解谱与其它8株噬菌体差异最大，9株噬菌体组合后裂解率从最低的32.22％提高到70.00％。
　　二、空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39生物学特性鉴定
　　为深入了解空肠弯曲菌噬菌体基本生物学特性，明确噬菌体遗传背景和基因组特性，选取噬菌体CP7和CP39进行裂解谱测定、形态学鉴定、最佳感染复数测定、一步生长曲线绘制、热稳定性、酸碱耐受性以及基因组酶切分析等生物学特性鉴定。同时对噬菌体CP39进行了全基因组测序和功能注释，比较CP39与其它弯曲菌噬菌体的讲化关系。
　　经透射电镜观察，噬菌体CP7和CP39属于肌尾噬菌体，均具有典型的弯曲菌噬菌体终端泡和空头。噬菌体CP7和CP39基因组大小相似，约为140kb，均属Ⅲ组弯曲菌噬菌体，基因组均能被限制性内切酶HindⅢ、HhaⅠ、DraⅠ、EcoRⅤ和TaqⅠ切开，其他限制性内切酶均不能消化。噬菌体CP7和CP39对pH耐受性较强，在pH值为3和12的环境中仍具有较高效价。噬菌体CP7和CP39最适宜温度均在50℃以下，但是CP7对高温的耐受性强于CP39。噬菌体CP7和CP39的潜伏期均为45min，CP7的裂解期120min，裂解量为354/cell，CP39的裂解期约60min，裂解量为177/cell。
　　基因组测序显示，噬菌体CP39全基因组大小为130.715kb，G+C含量为26％。CP39全基因组共包含有168个ORF和3个tRNA，其中54个ORF功能已知，114个ORF为假想蛋白表达序列。通过主要衣壳蛋白构建进化树与现有的11株弯曲菌噬菌体比对分析发现，噬菌体CP39与Ⅲ组噬菌体在同一簇中，与噬菌体vB_CjeM_Los1在同一分支中;与Ⅱ组弯曲菌噬菌体亲缘关系较远。噬菌体CP39全基因组分析未发现携带抗生素耐药基因和毒力基因。
　　三、空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39初步应用
　　鉴定了噬菌体CP7和CP39基本生物学特性后，通过多个单因素实验，探索噬菌体的最佳使用条件，分别摸索出噬菌体最佳作用时间为4h，最佳使用效价为1×1010pfu/ml，最佳作用温度为25℃。在此基础上，测定噬菌体对鸡粪便样品中的空肠弯曲菌消减效果。消减实验结果表明，噬菌体对弯曲菌的消减量在1-5log之间。200份样品中，37.5％(75)的样品消减量在5log左右，弯曲菌平均含量降至0.15lg cfu/g;57.0％(114)的样品消减量在2log左右，弯曲菌平均含量降至3.46lg cfu/g;5.5％(11)的样品消减量在1log左右，弯曲菌平均含量降至4.71lg cfu/g。

目录

摘要

综述 弯曲菌噬菌体研究进展

1 弯曲菌噬菌体的分离

1．1 弯曲菌噬菌体分离方法

1．2 弯曲菌液体培养技术

1．4 提高噬菌体分离率

2 弯曲菌噬菌体的鉴定

2．1 裂解谱鉴定

2．2 形态特征鉴定

2．3 基因分型

2．4 基因组序列测定

3 弯曲菌噬菌体应用

3．1 噬菌体防控效果

3．2 噬菌体应用方式

3．3 前噬菌体和噬菌体抗性

3．4 噬菌体鸡尾酒疗法

4 研究中存在的困难与挑战

4．1 多种细菌混合感染的防控

4．2 噬菌体应用的安全性

4．3 抗性菌株的产生问题

5 展望

参考文献

第一章 空肠弯曲菌噬菌体的分离和筛选

1 材料

1．1 菌株来源

1．2 样品来源

1．3 主要试剂和培养基

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 空肠弯曲菌复苏和菌悬液制备

2．2 样品采集

2．3 样品处理

2．4 噬菌体分离

2．5 高效价噬菌体制备

2．6 噬菌体初筛

2．7 噬菌体纯化

2．8 噬菌体扩大培养和冻存

2．9 噬菌体复苏

2．10 噬菌体裂解谱鉴定

2．11 噬菌体形态鉴定

2．12 统计学分析

3 结果

3．1 不同类型样品噬菌体分离率

3．2 不同养殖规模粪便样品噬菌体分离率

3．3 不同养殖模式粪便样品噬菌体分离率

3．5 噬菌体裂解谱测定

3．6 不同裂解谱噬菌体筛选

3．7 噬菌体形态鉴定

4 讨论

参考文献

第二章 空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39生物学特性鉴定

1．1 菌株来源

1．2 主要试剂和培养基

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 噬菌体复苏

2．2 高效价噬菌体制备

2．3 噬菌体效价测定

2．6 噬菌体一步生长曲线测定

2．7 噬菌体热稳定性测定

2．8 噬菌体pH稳定性测定

2．9 噬菌体形态鉴定

2．11 噬菌体基因组提取

2．12 噬菌体基因组酶切鉴定

2．13 噬菌体CP39全基因组测序

2．14 噬菌体CP39全基因组序列的拼接及注释

3 结果

3．2 噬菌体裂解谱

3．3 噬菌体最佳感染复数(MOI)

3．4 噬菌体一步生长曲线

3．5 噬菌体热稳定性

3．6 噬菌体pH稳定性

3．7 噬菌体形态鉴定

3．8 噬菌体基因组鉴定

3．9 噬菌体CP39全基因组概述

3．10 噬菌体CP39全基因组注释

3．11 噬菌体CP39进化分析

4 讨论

参考文献

第三章 空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39初步应用

1 材料

1．1 菌株来源

1．3 主要试剂和培养基

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 鸡粪便样品中弯曲菌含量测定

2．2 噬菌体复苏

2．3 高效价噬菌体制备

2．4 噬菌体效价测定

2．5 噬菌体最佳使用效价测定

2．6 噬菌体最佳作用时间测定

2．7 噬菌体最佳作用温度测定

2．8 噬菌体对鸡粪便中弯曲菌的消减效果测定

3 结果

3．4 噬菌体最佳作用温度

3．5 噬菌体对鸡粪便中空肠弯曲菌的消减效果

4 讨论

参考文献

附录

致谢

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