江苏省生猪屠宰场沙门菌污染关键点分析及定量微生物风险评估研究

摘要

沙门菌是重要的人兽共患病原菌之一，由沙门菌导致的人沙门菌病持续地威胁着人类健康，被污染的猪肉是人沙门菌病的主要原因之一。目前，中国关于生猪屠宰场中沙门菌污染的研究还鲜见报道，风险评估模型更是少之又少。本研究以江苏省某大型半自动化生猪屠宰场为研究对象，调查分析屠宰场的沙门菌污染状况和血清型分布，并利用多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和成簇的有规律地间隔交织的短回文重复序列(CRISPR)分型进行基因分型研究。另外，基于前期调查数据，利用@RISK软件建立定量微生物风险评估（Quantitative Microbial Risk Assessment,QMRA）模型。以期探明生猪屠宰场中沙门菌污染的主要环节及其污染方式，发现关键控制点，从而为沙门菌防控提供数据支持。
　　一、沙门菌的分离、鉴定和定量分析
　　2016年3月至2017年5月间，于江苏省某大型半自动化生猪屠宰场进行9次样品采集，共采集样品1116份，分离沙门菌342株，总分离率为30.6％。样品包括胴体擦拭样、器具样、环境样和肠道内容物。胴体擦拭样包括8个屠宰环节的生猪胴体的棉球擦拭样。放血作为第一个检测环节，呈较高的沙门菌检出率(46.9％)，胴体依次经燎毛和去毛后，沙门菌阳性率降至最低(12.2％)。在劈半后，沙门菌检出率达到最高(64.6％)，清水淋洗后沙门菌检出率大幅下降至32.7％。经修饰后检出率略微升高(41.8％)，之后，沙门菌检出率经二次淋洗和冷却后依次降低。在器具擦拭样品中，劈半刀检出率最高(38.5％)。环境样品中待宰圈和屠宰地而均被沙门菌大量污染（40.0％和40.7％）。肠道内容物中沙门菌检出率为23.9％。
　　血清型鉴定结果显示，优势血清型为德尔卑沙门菌(39.8％)，其次为鼠伤寒(25.4％)和罗森沙门菌(23.1％)，这三种血清型几乎在每次采样中均有检出且大量存在。
　　最大似然数法(MPN)用于检测生猪胴体上的沙门菌污染量。放血环节和劈半环节呈高的污染量（2.50±0.94和2.24±0.72log MPN/m2），其余环节均呈低水平。总体变化趋势与检出率基本一致。
　　二、沙门菌的分子分型研究
　　应用MLST将216株沙门菌分成10种ST型，主要ST型为ST40、ST469、ST34和ST155，且上述四种来源样品的沙门菌分离株均包括了这四种ST型。另外，ST型和血清型均呈特定的对应关系。
　　112株德尔卑沙门菌和55株鼠伤寒沙门菌被用于PFGE分型。结果表明，德尔卑沙门菌和鼠伤寒沙门菌分布于两个不同的大簇中，同一批次和不同批次中的分离株均可分布在同一簇中。待宰圈、劈半刀和刮毛刀的分离株所在的同源簇中包括了多个批次的沙门菌分离株。劈半刀与各环节胴体分离株条带高度一致。47株德尔卑沙门菌和39株鼠伤寒沙门菌被用于CRISPR分型，也显示出与PFGE分型相似的结果。
　　上述两章节表明，(1)外源引入的沙门菌和屠宰场内部常驻菌群均是造成屠宰场内生猪胴体污染的原因，被感染生猪是外源引入沙门菌的主要方式，待宰圈、劈半刀和刮毛刀是常驻菌群长期寄居的主要途径;(2)沙门菌的污染发生在“磨光-劈半”间，在此过程中包括了劈半刀和刮毛刀;(3)烫毛、去毛、淋洗和冷却均可降低沙门菌胴体污染。
　　三、定量微生物风险评估模型的建立
　　应用国际上广泛使用的定量风险评估软件@RISK实现沙门菌污染的定量微生物风险评估。放血后作为模型的输入，中间环节为烫毛、去毛、燎毛、磨光、去内脏、劈半和淋洗，冷却后作为模型的输出。在各个环节引入相关的风险因子，以及这些因子影响此环节输出的相关计算，因子的参数参考文献或生产经验，建立了较为复杂的定量微生物风险评估模型。最后使用Monte Carlo模拟技术对各加工环节中胴体的沙门菌数进行模拟计算，迭代次数为10000次。
　　模拟结果表明，在去毛后、燎毛后、劈半后、淋洗后和冷却后的输出结果（平均值）依次为53.83、27.83、534.82、34.28和46.26MPN/m2，本研究中的检测值（平均值）依次为61.79、32.46、1074.44、42.26和32.67MPN/m2。模拟结果和实际检测结果较为吻合，说明此模型较为准确地反映出生猪屠宰场中沙门菌污染的一个动态变化。
　　敏感性分析中，“方差贡献”方法用于模型中风险因子的比重分析。结果表明，去内脏环节的肠道破损率(42.7％)、肠道粪便沙门菌浓度(7.19％)和粪便带菌率(3.89％)以及淋洗环节的淋洗时间(29.64％)、放血环节的沙门菌污染浓度(7.35％)是生猪屠宰过程中重要的风险因子。
　　敏感性分析的结果与上述两章节的结论相互印证和补充。被感染生猪是外源引入沙门菌的主要方式，那么风险因子B（代表胴体表面初始的沙门菌污染浓度）与之相对应。沙门菌的污染多是发生在“磨光-劈半”间，三个风险因子（α6、Pmpn6和β6）正是处于“磨光-劈半”间的去内脏环节。淋洗可降低沙门菌胴体污染，其中淋洗时间(Tmpn7)也与淋洗环节相对应。

目录

摘要

符号说明

猪肉生产链中的沙门菌及其对人类健康的影响

1 猪肉生产链中的沙门菌

1．1 猪沙门菌病

1．2 猪场

1．3 运输和待宰静养

1．4 屠宰

2 猪源沙门菌与人类健康

结论

第一章 沙门菌的分离、鉴定和定量分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．1 沙门菌分离率

2．2 沙门菌血清型鉴定

2．3 沙门菌污染量

3 讨论

参考文献

第二章 生猪屠宰场中沙门菌的分子分型研究

1．1 材料

1．2 方法

2．1 MLST分型

2．2 PFGE分型

2．3 CRISPR分型

3 讨论

参考文献

第三章 定量微生物风险评估模型的建立

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 建模工具

2 结果

2．1 刮毛后的沙门菌污染水平

2．2 燎毛后的沙门菌污染水平

2．3 劈半后的沙门菌污染水平

2．4 淋洗后的沙门菌污染水平

2．5 冷却后的沙门菌污染水平

2．6 模型结果与实际检测结果的比较

2．7 敏感性分析

3 讨论

参考文献

致谢

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