表达H5亚型禽流感病毒Mosaic HA蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建与免疫效力的测定

摘要

H5亚型禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏RNA病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性、高致病性传染病，对家禽的致死率可达100％。H5亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)的自然宿主是水禽，但其宿主范围已扩大到可感染多种哺乳动物，甚至是引起人类死亡，并且随着候鸟的迁徙传播到多个洲，因此家禽H5亚型禽流感的有效防控对人类的公共卫生安全至关重要。H5亚型禽流感病毒表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)变异迅速，在遗传进化上产生很多不同的分支，近几年我国主要流行clade2.3.4.4和clade2.3.2.1两个分支，目前禽流感的控制主要是通过疫苗免疫，常用的疫苗分别为Re-8和Re-6灭活疫苗。H5AIV的暴发往往是由于现有疫苗的抗原性与流行株抗原性不匹配，每当病毒抗原变异或重组，新的毒株出现时，就需要筛选新的疫苗株，这个过程耗时费力，而且几乎每隔2～5年就需要更新疫苗。因此广谱疫苗的开发成为目前流感疫苗研究的一个热点，包括设计针对流感病毒保守区域如茎部的疫苗、Mosaic疫苗等。另外，现有的商品化疫苗通常为灭活疫苗，主要刺激机体产生体液免疫应答，不同于活疫苗能同时激发机体的体液免疫和细胞免疫，而细胞免疫在机体清除流感病毒的过程中也发挥十分重要的作用，用活病毒载体表达流感病毒HA基因是流感病毒活疫苗研究的主要方向之一，比较常见的病毒载体有火鸡疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、新城疫病毒等。因此，研制一种具有交叉保护性、又能同时激发体液和细胞免疫的疫苗具有实际意义。
　　1H5亚型禽流感病毒Mosaic HA基因重组转移质粒的构建
　　参照HIV Mosaic疫苗设计原理，利用公共网站设计一条H5“mosaic”蛋白。首先下载流感病毒数据库GISAID（http://platform.gisaid.org/epi3/frontend＃48ef8b）中所有上传的H5HA序列，剔除不完整和重复的序列后比对分析并绘制遗传进化树，然后选取其中clade2分支的基因序列翻译成氨基酸序列，上传到“Mosaic Vaccine Designer”（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/MO SAIC/makeVaccine.html），通过网站上自带的Mosaic Tool优化获得H5Mosaic蛋白序列(H5M)，并使用该网站中两个在线工具Epitope Coverage Assessment Tool(Epicover)和Positional Epitope Coverage Assessment Tool(Posicover)预测H5M的抗原表位覆盖率。结果显示，H5M序列的表位覆盖率显著高于4株H5AIV野毒株（SQ1402、YZ1111、Z6285和0520），如H5M对4933条自然毒株HA序列的9表位长度的精确匹配率(9/9)为72.99％，8/9匹配率为92.64％，7/9匹配率为98.01％;而4株野毒株HA氨基酸序列的9表位长度的精确匹配率为56.12％～56.3％，8/9匹配率为79.33％～83.98％，7/9匹配率为92.88％～95.16％。由此可见，Mosaic序列比天然序列包含有更多的潜在抗原表位。将得到的H5M蛋白序列按照鸡源(Gallus Gallus)密码子优化后，合成相应的基因序列，并分别构建到含强启动子Pec和弱启动子HgB的中间质粒上。此外，分别选取当前优势流行株SQ1402(clade2.3.2.1)和YZ1111(clade2.3.4.4)作为自然毒株序列的对照，按相同方法分别构建了含强、弱两种启动子的转移质粒。经测序、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定，所构建的6个中间转移质粒均能正确表达外源目的基因。
　　2表达H5亚型禽流感病毒Mosaic HA蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫效力的评价
　　利用同源重组原理，采用磷酸钙转染法将表达绿色荧光蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GFP)基因组DNA与上述构建好的中间转移质粒共同转染CEF细胞，经筛选、纯化和鉴定，共获得4株重组HVT，分别为rHVT-H-H5M、rHVT-P-SQ1402、rHVT-H-SQ1402、rHVT-H-YZ1111（有两个插入强启动子的质粒未能产生重组病毒）。4株重组HVT在CEF细胞上连续传15代来分析重组HVT的遗传稳定性，用IFA测定每5代重组HVTHA蛋白的表达，结果显示，所获得的4株重组HVT连续传代15代后仍能稳定表达目的蛋白。进一步评价rHVT-H-H5M疫苗对H5AIV的免疫保护效果，将4株重组疫苗rHVT-H-H5M、rHVT-P-SQ1402、rHVT-H-SQ1402和rHVT-H-YZ1111分别免疫1日龄SPF鸡。在免疫后第1、2、3、4、5周采集外周血检测其HI抗体水平。在免疫后第5周，分别用H5AIV相应分支的0520(clade2.3.4.4)和Z6285(clade2.3.2.1)两个毒株对免疫组进行攻毒试验。结果表明，在相同载体、相同启动子的情况下，重组Mosaic H5病毒rHVT-H-H5M比其他自然毒株HA重组病毒rHVT-H-SQ1402、rHVT-H-YZ1111在交叉保护上显示出绝对优势，可对clade2.3.4.4和clade2.3.2.1产生保护，保护率分别为60％和90％。在插入相同目的片段的情况下，带有强启动子(Pec)的重组病毒rHVT-P-SQ1402比带有弱启动子(HgB)的重组病毒rHVT-H-SQ1402能诱导产生更高的抗体水平，且攻毒后更能保护鸡体。尽管rHVT-P-SQ1402对同分支(clade2.3.2.1)能提供100％的保护，但对另一分支(clade2.3.4.4)却只能提供30％的保护，只有rHVT-H-H5M能同时对两个分支能提供更高的临床保护率和显著降低排毒水平。
　　综上所述，本研究成功地构建了一株表达Mosaic H5HA的重组火鸡疱疹病毒载体疫苗(rHVT-H-H5M)，该疫苗可对我国当前H5亚型禽流感病毒优势流行的两个分支clade2.3.4.4和clade2.3.2.1产生一定交叉保护效果。该研究为广谱疫苗的研制提供了一种新的思路和方法，奠定了一定的理论基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 综述

1 H5亚型禽流感流行现状

1．1 H5亚型禽流感病毒是高致病性禽流感病毒的主要亚型之一

1．2 H5亚型禽流感病毒HA基因高度变异

1．3 H5亚型禽流感病毒抗原变异要求不断更新疫苗株

2 火鸡疱疹病毒载体疫苗概述

2．1 火鸡疱疹病毒作为疫苗载体的优势

2．2 影响火鸡疱疹病毒疫苗效果的主要因素

2．3 重组AIV-火鸡疱疹病毒载体疫苗的研究进展

3 Mosaic疫苗概述

3．1 Mosaic疫苗的原理

3．2 Mosaic疫苗的获得方法

3．3 Mosaic疫苗的研究进展

第二章 H5亚型禽流感病毒Mosaic HA基因重组转移质粒的构建

引言

1．1 鸡胚

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要分子生物学软件

2 方法

2．1 H5亚型禽流感病毒HA基因大数据分析

2．2 Mosaic HA蛋白序列的获得

2．3 Mosaic HA蛋白序列的分析

2．4 Mosaic基因序列的合成

2．5 自然毒株HA基因序列的选取与克隆

2．6 重组质粒的构建

2．7 H5M表达性验证试验

3 结果

3．1 成功获得Mosaic序列

3．2 Mosaic序列的分析

3．3 Mosaic序列的合成

3．4 质粒PCR鉴定

3．5 免疫荧光试验检测H5M的表达

4 讨论

第三章 表达H5亚型禽流感病毒Mosaic HA蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及疫苗免疫效力的评价

引言

1 材料

1．1 鸡胚及实验动物

1．2 毒株、质粒和细胞

1．3 主要试剂与仪器

2 方法

2．1 转染用重组转移质粒的提取

2．2 转染用rHVT-GFP基因组DNA的制备

2．3 磷酸钙法共转染

2．4 重组病毒的筛选、鉴定和纯化

2．5 重组火鸡疱疹病毒的扩大培养与冻存

2．6 遗传稳定性试验

2．7 重组火鸡疱疹病毒PFU的测定

2．8 攻毒毒株的准备

2．9 SPF鸡疫苗攻毒保护试验

3 结果

3．1 重组火鸡疱疹病毒的获得

3．2 重组火鸡疱疹病毒的鉴定

3．3 遗传稳定性试验

3．4 HI抗体水平检测

3．5 攻毒保护率

3．6 攻毒后排毒情况

4 讨论

参考文献

全文小结

附录

致谢

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