FRG3在抗番茄枯萎病过程中的功能研究以及番茄枯萎病病原菌的快速检测

摘要

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一类既可以侵染宿主植物又可以在土壤内生存的兼性寄生真菌，存在种下分化，具有多种专化型。尖孢镰刀菌的寄主范围非常广泛，可引起茄科、豆科、瓜类等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici，FOL，FGSC9935）导致的番茄枯萎病给全球农业生产造成巨大的经济损失。目前对于番茄抗枯萎病的研究主要集中在抗性品种的培育等方面，从寄主抗性相关基因的功能方面的探索番茄抗尖孢镰刀菌分子机理的研究还处于初期阶段。
　　1、FRG3在抗番茄枯萎病过程中的功能研究
　　NBS-LRR(Nucleotide-binding site-Leucine-reach repeats)类蛋白是植物抗性基因(R)编码的R蛋白，是植物机体内数量最多的一类R蛋白家族。本论文以NBS-LRR类抗性基因FRG3为研究对象，分析其在抗番茄枯萎病过程中的功能。(1)本研究利用番茄枯萎病病原菌尖孢镰刀菌番茄专化型(FOL)，对具有相似遗传背景的番茄抗病品系Motelle(Mot)和感病品系Moneymaker(MM)进行侵染，总共构建4个文库，包括:用H2O处理Moneymaker(MM_H2O)，用FOL处理Moneymaker(MM_FOL)，用H2O处理的Motelle(Mot_H2O)和用FOL处理的Motelle(Mot_FOL)。通过生物信息学对sRNA-seq数据进行分析，结果表明slmiR482家族成员的表达受FOL侵染调控。(2)综合sRNA Northern Blot和qRT-PCR分析，发现slmiR482e-3p在抗性品系Mot中表达下调。(3)通过生物信息学预测表明FRG3是slmiR482e-3p的靶基因，编码一个含有卷曲螺旋(CC)结构域和P环结构域(P-loop)的NBS类抗病蛋白。(4)通过序列同源进化比较，FRG3与已知的抗性基因I2家族同源性较远，暗示FRG3蛋白在番茄抗枯萎病的过程中通过不同的方式参与了番茄抗枯萎病的过程。(5)通过烟草共表达，证实了FRG3在转录水平上受到slmiR482e-3p调控。(6)通过5'RACE的方法，确定slmiR482e-3p对FRG3的切割发生在miRNA的3'末端，多数在第10个核苷酸之后。(7)通过病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)方法在抗性品系Mot中部分沉默FRG3，结果显示FRG3的表达下调能导致Mot对FOL的敏感性，表明FRG3在一定程度上参与了番茄抗枯萎病的过程。
　　总之，本研究发现了一个新的R基因FRG3，其在转录水平上受slmiR482e-3p调控来参与番茄抗枯萎病的过程。本研究结果为研究番茄抗病性的分子机理，并由此开发长治有效防治病害的新技术将具有重要的应用价值。
　　2、番茄枯萎病病原菌的快速检测
　　番茄枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，病原菌能在土壤中越冬并且能存活数年，一旦被侵染，FOL就能在植株的维管束中由下向上蔓延。并会导致连年发病，难以根治。目前最主要的防治方法是选用番茄枯萎病抗病品种，但是至今并未培育出高抗的品种，因此做好番茄枯萎病的预测预报工作就显得尤为重要。本研究以感病品系MM为研究对象，探究番茄植株体内中病原菌的数量与发病程度之间的关系。(1)使用FOL对感病品系MM进行侵染，病原菌引起的番茄枯萎病会影响植株生长态势和植株维管束。(2)使用q-PCR，对FOL特异性引物的植物DNA进行扩增，建立了评估病原菌生物量的标准曲线。(3)通过q-PCR方法快速准确检测出植株中番茄尖孢镰刀菌的生物量，建立病原菌生物量与番茄枯萎病的发生及病害程度的关系。
　　本研究结果对指导大田生产番茄枯萎病的发病早期预测预报有一定实际应用价值。

目录

摘要

第一章 前言

1 研究背景

1．1 番茄的植物史

1．2 番茄的价值

1．3 番茄种植、生产地分布

1．4 番茄病害

2．1 番茄枯萎病常见症状

2．2 番茄枯萎病病原菌的生物学特性

3 番茄与尖孢镰刀菌互作研究进展

3．1 基因水平的互作

3．2 化合物水平的互作

3．3 small RNA水平的互作

4 MicroRNA(miRNA)的研究进展

4．1 miRNA的发现

4．2 miRNA的生物合成

5 miRNA在植物与病原菌互作中的研究进展

5．2 miRNA调节宿主防御机制

5．3 miRNA调节病原体防御

7 NBS-LRR抗病蛋白在植物抗病中的功能

8 农作物真菌病害的快速分子诊断技术

9 研究目的、意义

第二章 FRG3在抗番茄枯萎病过程中的功能研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 鉴定尖孢镰刀菌侵染条件下番茄根中诱导的miRNA

2．2 在番茄根中shniR482家族响应FOL的特征

2．3 FOL slmiR482e-3p靶基因的预测及表达

2．4 FRG3对番茄FOL侵染的反应表达

2．5 slmiR482e-3p调控职G3表达方式的鉴定

2．6 通过5'RACE的方法检测slmiR482e-3p与FRG3的切割位点

2．7 通过VIGS系统在Mot品种部分沉默FRG3降低了对FOL的抗性

2．8 FRG3敲除／过表达材料构建

2．9 FRG3基因敲除番茄外植体转化

3 讨论

第三章 番茄枯萎病病原菌的快速检测

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 番茄枯萎病影响植生长态势和植株维管束

2．2 FOL特异性引物灵敏度检测

2．3 发病植株体内病原菌的快速检测

3 讨论

附录

攻读学位期间发表的论文

致谢

参考文献

声明