黄瓜低温胁迫与恢复过程中水苏糖合成酶与α-半乳糖苷酶在RFOs代谢中的作用

摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.）反季节栽培时经常遭遇低温胁迫，研究其低温响应机制将有助于创制黄瓜耐低温栽培和育种的新方法。积累棉籽糖家族寡糖（RFOs）是植物抵御低温胁迫的有效途径之一，前期研究表明，黄瓜作为一种RFOs运输型植物，低温同样会导致RFOs在叶片中积累，低温解除后RFOs含量又逐步恢复至正常水平。但是，在低温胁迫与解除过程中，RFOs合成与分解的生理过程并不清楚。水苏糖合成酶(STS，EC.2.4.1.67)和α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)分别是催化水苏糖合成与分解的关键酶。黄瓜叶片中存在3种不同的STS转录本和6种不同的α-半乳糖苷酶转录本，其中各STS转录本由同一基因编码、通过选择性剪切生成;而各α-半乳糖苷酶转录本则是由6个不同的基因所编码。在低温胁迫与解除过程中，这些转录本在RFOs合成与降解中的具体作用目前不清楚。
　　为此，本试验首先建立了特异鉴定3种STS转录本的方法，探明了这3种转录本的稳定性及其受胞内糖水平调节表达的特点，并在此基础上研究了STS与α-半乳糖苷酶各种转录本在黄瓜低温胁迫与解除过程中的表达、酶活性及相关糖含量的变化。此外，前期研究表明黄瓜低温胁迫后RFOs在液胞、细胞质、叶绿体中均有积累，低温解除后各亚细胞空间中的RFOs水平均逐步下降至正常水平。为探索各亚细胞空间中的RFOs分别由哪种α-半乳糖苷酶分解，本实验还研究了各种α-半乳糖苷酶亚细胞定位。所得结果如下:
　　1.本试验建立的“3碱基锚定引物法”可特异鉴定3种STS转录本，保证在实时荧光RT-PCR反应中特异地区分3种转录本，为后续研究提供了有效实验手段。
　　2.黄瓜愈伤组织STS的表达丰度显著低于叶片。黄瓜愈伤组织转至无糖MS培养基后，3种STS转录本的表达量上升;将愈伤组织从无糖培养基再转入蔗糖、棉籽糖、水苏糖、半乳糖为碳源的MS培养基中，3种STS转录本的表达量下降;表明STS各转录本的表达受细胞内糖水平的调节。放线菌素D抑制实验结果表明，STSⅡ转录本的稳定性显著低于其他2种转录本。
　　3.黄瓜叶片中STSⅠ、STSⅡ的表达丰度显著高于STSⅢ，在黄瓜低温适应过程中起主导作用。4℃低温胁迫后，黄瓜叶片中各可溶性糖含量上升，3种STS转录本表达上调，酶活性提高。结合愈伤组织的研究结果，表明该上调确为低温所诱导，而不是糖水平上升所导致。恢复至常温后，各可溶性糖含量下降，酸性α-半乳糖苷酶3基因（GAL3）、碱性α-半乳糖苷酶2和3基因(AGA2，AGA3)的表达上调，GAL和AGA活性上升，表明这3个基因在温度恢复后RFOs降解过程中起重要作用。
　　4.亚细胞定位研究结果表明，GAL1与GAL2定位于细胞壁;GAL3主要分布于液胞;AGA1和AGA2主要分布于细胞质;AGA3则定位于叶绿体。结合前期研究结果，表明低温解除后，GAL3、AGA2，AGA3分别在液胞、细胞质和叶绿体中起降解RFOs的作用。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 棉籽糖家族寡糖(RFOs)简介

1．1．1 RFOs的生物合成

1．1．2 RFOs的代谢途径

1．2 水苏糖合成酶研究进展

1．2．1 水苏糖合成酶与逆境胁迫反应

1．3 选择性剪切

1．3．1 选择性剪切研究进展

1．3．2 黄瓜水苏糖合成酶基因选择性剪切

1．3．3 选择性剪切与非生物胁迫

1．4 α-半乳糖苷酶细胞定位

第二章 特异鉴定3种STS转录本方法的建立

2．1．1 3种STS转录本模板RNA的制备

2．1．2 锚定引物RT-PCR方法的建立

2．2 结果与分析

2．2．1 3种STS转录本模板RNA的制备

2．2．2 实时定量锚定引物特异性验证

2．3 讨论

第三章 3种STS转录本基本特性研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 糖处理及取样方法

3．1．3 荧光定量RT-PCR方法(绝对定量)

3．1．4 STS的提取与测定

3．2 结果与分析

3．2．1 产物与底物对STS表达和活性的影响

3．2．2 3种STS转录本的稳定性研究

3．3 讨论

第四章 低温胁迫下STS与α-半乳糖苷酶各种转录本的表达

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料及栽培管理

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 STS在低温胁迫中的作用

4．2．2 低温胁迫与恢复过程中α-半乳糖苷酶的作用

4．2．3 α-半乳糖苷酶亚细胞定位

4．3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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