徐州地区鸭源沙门菌分离鉴定、耐药性检测、LAMP检测方法建立及中药防治研究

摘要

沙门菌（Salmonella）是肠杆菌科中最常见的病菌原之一，常寄生于动物和人的肠道内，是引起人类食物中毒最主要的病原菌。本研究分离鉴定了徐州及周边地区养殖场鸭、禽病门诊病鸭、菜场和超市里鸭肉及副产品中沙门菌，通过血清型分型、ERIC-PCR分子分型方法分析沙门菌的分布情况;进一步对分离的鸭源沙门菌的耐药性和耐药表型进行研究;建立fimA-LAMP检测方法，并在临床上进行验证;此外筛选了针对鸭源沙门菌的中药复方制剂，希望可对鸭沙门菌病的防控提供理论和技术支持。 1.鸭源沙门菌的分离培养、鉴定、血清型分型及ERIC-PCR分子分型 本研究从徐州及周边地区采集6个养鸭场的380份肉鸭泄殖腔肛拭子样品、禽病门诊50例临床发病鸭的脏器组织、市场的300份鸭肉及副产品样品，利用经典分离方法，结合PCR验证，共分离到56株沙门菌。从鸭场分离到26株沙门菌，分离率为6.84％;其中24株沙门菌属于4个血清型，分别为鼠伤寒沙门菌2株(8.33％)，印第安纳沙门菌4株(16.67％)，鸭沙门菌2株(8.33％);肠炎沙门菌16株(66.67％)，优势血清型为肠炎沙门菌。临床发病鸭分离到24株沙门菌，分离率为48％;分为6个血清型，鼠伤寒沙门菌3株(12.5％)，阿贡纳沙门菌2株(8.33％)，波茨坦沙门菌2株(8.33％)，印第安纳沙门菌10株(41.67％)，鸭沙门菌1株(4.17％);肠炎沙门菌6株(25.0％)，其中优势血清型为印第安纳沙门菌。市场共分离到6株沙门菌，分离率为2％;其中5株分为两个血清型，肠炎沙门菌4株(80％)、1株为印第安纳沙门菌(20％)，优势血清型为肠炎沙门菌。对其中21株沙门菌进行ERIC-PCR分子分型，分成18个基因型，遗传相似性在59％～100％之间，结果显示出良好的多态性并获得了较好的指纹图谱数据。 2.鸭源沙门菌耐药性检测及耐药基因的分析 用Kirby-Bauer(K-B)法测定分离的56株鸭沙门菌对20种抗菌药物的耐药性。合成19对引物，对6大类耐药基因进行检测。分离的沙门菌对20种抗生素具有不同的耐药率和多重耐药现象，对链霉素耐药率最高(98.2％)，其次是氨苄青霉素(94.6％)，耐药表型主要为AStAC、ANStOCSx和AAKDOCSx。检测的19种耐药基因中，blaTEM-1、aadA1、aadA2、aph(3')-Ⅱ a、tetA、gyrA、Sul2、drfⅫ基因的检出率超过50％以上，其中aadA1基因检出率最高(91.1％)，其次是blaTEM-1基因(83.9％)，没有检测到tetC基因。抗生素耐药基因检测与耐药表型基本相符。 3.基于fimA基因的鸭源沙门菌LAMP快速检测方法的建立与应用 以fimA菌毛基因为检测靶基因，设计两对特异性引物，建立快速检测沙门菌的环介导等温扩增方法。并对反应条件进行一系列优化，包括反应温度、检测特异性和灵敏度等，并将LAMP与常规PCR进行比较，用建立的方法对临床样品进行检测。结果显示: LAMP方法最适反应温度为64℃，Mg2+浓度为8mmol/L、dNTPs浓度为0.8mmol/L、内外引物浓度比为1∶8。对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增，仅沙门菌扩增阳性。对沙门菌检测的灵敏度为8.6×101cfu/mL，比PCR灵敏10倍。运用建立的方法对市场肉类产品进行检测，与传统方法比较，符合率100％。LAMP方法特异性强、灵敏度高、结果可视，且操作简单，无需昂贵的仪器，适合基层实验室应用。 4.筛选治疗鸭源沙门菌感染的中药复方制剂的筛选 研究以白头翁为主药复方制剂的体外抑菌效果及对人工感染沙门菌雏鸭的治疗效果。体外抑菌实验中，复方制剂4的抑菌圈直径最高，达到17.6mm，最低抑菌浓度为166.7mg/mL，明显高于其它各组，说明沙门菌对复方制剂4高度敏感;体内实验结果显示高剂量组的治疗效果最好，保护率可以达到80％，与头孢噻呋组接近。攻毒后，血液中的红细胞数量显著降低、白细胞数量显著升高（P≤0.01），给予中药治疗后9～12d，红细胞数量、白细胞数量恢复或接近正常水平，说明以白头翁为君药的复方制剂4对雏鸭沙门菌病有很好的治疗效果。

目录

摘要

符号说明

文献综述

1沙门菌简介

1．1沙门菌生物学特性

1．2沙门菌血清学特性

1．3鸭沙门菌临床症状

1．4鸭沙门菌病理变化

1．5沙门菌致病机制

2沙门菌分型技术研究进展

2．1沙门菌表型分型法

2．2沙门菌分子分型法

3沙门菌耐药性

3．1沙门菌的耐药现状

3．2沙门菌的耐药机制

4沙门菌的检测方法

4．1细菌学检测方法

4．2免疫学检测方法

4．3分子生物学检测方法

5中草药在禽病防治中的应用

5．1中草药防治禽病的机理

5．2中草药制剂防治鸡沙门菌病

第一章不同来源鸭沙门菌的分离鉴定及ERIC-PCR分型

1材料

1．1材料

1．2试剂

1．3主要培养基的配制

1．4试验仪器

2方法

2．1样品的采集

2．2沙门菌的分离培养

2．3初步筛选

2．4生化鉴定

2．5 PCR检测

2．6血清学试验

2．7沙门菌ERIC-PCR分型

3结果

3．1分离培养与染色镜检

3．2生化鉴定

3．3 PCR检测结果

3．4血清型定型

3．5 ERIC-PCR分型结果

4讨论

第二章鸭沙门菌耐药性及耐药基因的检测与分析

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2结果

2．1沙门菌对抗生素的耐药性

2．2耐药基因检测情况

3讨论

第三章沙门菌 fimA-LAMP快速检测方法的建立

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2结果

2．1 LAMP方法建立结果

2．2 LAMP反应条件的优化

2．3特异性试验结果

2．4灵敏度试验结果

2．5稳定性试验结果

2．6样品检测

3讨论

第四章中药复方制剂对雏鸭沙门菌药效学试验

1材料

1．1药材

1．2菌株

1．3动物

1．4培养基

1．5试剂

1．6仪器

2方法

2．1中药组方

2．2药液煎制

2．3菌液制备

2．4体外抑菌试验

2．5体内抑菌试验

3结果

3．1复方中药对沙门菌的抑菌效果

3．2雏鸭沙门菌病人工模型结果

3．3复方组方4对雏鸭沙门菌病人工模型的防治试验结果

3．4血常规变化

4讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文、申请专利及专著

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