靶向23SrRNA domainⅡ区的多肽核酸(peptide nucleic acids，PNAs)抑制蛋白翻译和细菌生长的研究

摘要

目的：⑴构建能在大肠杆菌BL21（DE3）和体外翻译系统中大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白（EGFP）的pET28a—EGFP载体。⑵尝试研究反义多肽核酸（PNA）在体外翻译系统中抑制细菌蛋白的翻译。⑶研究肽—PNA（G1138）抑制细菌生长效果。 方法：①以质粒pEGFP—N1为模板采用聚合酶链反应（PCR）方法特异性扩增EGFP cDNA序列，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切EGFP cDNA序列和pET28a载体，T4DNA连接酶连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α。对重组质粒酶切鉴定和DNA测序，正确重组的表达型质粒命名为pET28a—EGFP。将正确重组的质粒pET28a—EGFP转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。荧光显微镜观察荧光，用western blot鉴定EGFP。在体外翻译系统中加入重组pET28a—EGFP模板，孵育2小时后，荧光显微镜观察荧光。第一抗体分别为EGFP抗体、T7—tag抗体和His—tag抗体的western blotting鉴定体外翻译系统中的EGFP。②以增强绿色荧光蛋白（EGFP）为报告分子，将重组载体pET28a—EGFP和靶向23SrRNA domainⅡ区的PNAs在体外翻译系统中共同孵育后，用荧光显微镜和荧光分光光度计观察荧光强度减弱，放射自显影证明荧光强度减弱是因为EGFP减少。为了分析PNAs体外抑制蛋白翻译的浓度，我们用蛋白沉淀方法分析PNAs体外抑制[35S]—met渗入蛋白比例。最后，用浊度分析观察PNA在MH肉汤培养基中的抑菌作用。③用浊度分析观察肽—PNA（G1138）抑制大肠杆菌DH5a的生长。用克隆形成单位（CFUs）进一步分析肽—PNA（G1138）抑菌效果。 结果：⑴经测序证实，重组质粒pET28a—EGFP中的EGFP cDNA序列与GenBank的EGFP cDNA序列完全一致，荧光显微镜下观察到大肠杆菌BL21（DE3）和体外翻译系统中强烈荧光，Western blotting结果显示分子量约为2.7kd的天然型EGFP在大肠杆菌BL21（DE3）和体外翻译系统中高效表达。⑵在体外翻译系统中，靶向23SrRNA domainⅡ区的PNA（G1138）以剂量和序列依赖方式抑制蛋白合成，抑制效果和四环素相当，抑制浓度（IC50）分别是0.15μmol/L和0.12μmol/L。PNA（G1138）在MH肉汤培养基中的抑菌效果不明显，最小抑菌浓度>50μmol/L。⑶靶向23SrRNA domainⅡ区肽—PNA（G1138）显示出剂量和序列特异性抑制细菌生长，但是肽—PNA（G1138）的最小抑菌浓度（MIC）明显高于四环素，抑制效果明显低于四环素。它们的最小抑菌浓度（MICs）分别是10μmol/L和4μmol/L。 结论：①成功构建了能在BL21（DE3）大肠杆菌和体外翻译系统中高效表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白（EGFP）的pET28a—EGFP载体。为体外研究提供了可靠的报告分子。也为进一步建立荧光强度标准奠定了基础。同时，提供了一种设计引物的新思路。②23SrRNA domainⅡ区的G1138位点是设计PNA基础的反义抑菌药物的理想靶位。PNA（G1138）不能被大肠杆菌DH5α有效吸收。③10μmol/L的Peptide—PNA（G1138）能够抑制大肠杆菌DH5α的生长，但与四环素和其它靶向23SrRNA domain V区的PNAs比较起来抑菌效果不理想。筛选更有效的转运肽，提高peptide—PNA（G1138）的抑菌效果，这是以后研究将要努力解决的问题。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

前言

第一部分可溶性天然型增强绿色荧光蛋白在大肠杆菌和体外翻译系统中的表达

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分靶向23SrRNA domain Ⅱ区的多肽核酸(PNAs)体外抑制细菌蛋白翻译

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三部分靶向23SrRNA domain Ⅱ区的肽-PNAs抑制细菌生长的研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

小结

参考文献

综述多肽核酸在医学和生物学上的应用

博士期间发表的论文

致谢