伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病细胞模型的建立及亚砷酸对抗慢性粒细胞白血病的作用及机制

摘要

目的：⑴评价伊马替尼（IM）与亚砷酸（ATO）联合应用治疗慢性粒细胞白血病（CML）的疗效及患者的耐受性。⑵建立IM耐药患者ABL激酶区（KD）点突变的检测方法，研究发生IM耐药的CML患者Bcr—Abl融合基因ABLKD发生点突变的情况。⑶建立IM耐药的CML细胞模型。⑷探讨ATO与IM是否存在交叉耐药现象以及ATO对Bcr—Abl阳性细胞的作用是否存在靶向性，探讨ATO与IM对IM耐药细胞株联合应用的性质，探讨ATO对IM耐药的CML细胞株的作用及其作用机制。⑸探讨ATO对裸鼠32D/p210移植瘤的抗肿瘤作用及机制，并探讨ATO的毒副作用。 方法：①20例初诊CML慢性期（CP）患者口服伊马替尼400mg/d，并静脉滴注ATO注射液10mg/d，连续10d后，改为每周2次。在IM治疗后中位时间为一年的期间内，观察疗效及副作用。②采集11例发生IM耐药（血液学耐药7例，遗传学耐药4例）的CML患者IM治疗前后不同时间段共计17份骨髓，采用半筑巢式扩增长片段逆转录—聚合酶链式反应（RT—PCR）的方法，扩增Bcr—Abl融合基因ABLKD周围863bp碱基，进行纯化、测序及序列同源性分析。③将分别含有全长Bcr—Abl融合基因发生IM耐药的T3151及E255K点突变的逆转录病毒载体MIGR1p210/T315I及MIGR1p210/E255K经亚克隆、纯化、PCR鉴定后，采用逆转录病毒介导的细胞转染技术分别转染到到依赖细胞因子生长的髓系原始细胞32D细胞中，筛选出表达Bcr—Abl的细胞，然后用荧光显微镜及蛋白免疫印记等方法鉴定阳性克隆，并分离单个克隆。经实时定量PCR（RQ—PCR）检测各细胞株Bcr—Abl融合基因拷贝数。④采用四氮唑蓝（MTT）法测定IM、ATO单独及联合应用于32D/MIG、32D/p210、32D/p210T315I及32D/p210E255K的IC50。测定伊马替尼、亚砷酸单独及联合应用于32D/p210及32D/p210E255K的IC80，计算联合应用指数。通过流式细胞仪检测ATO对32D/p210、32D/p210T315I及32D/p210E255K细胞凋亡及免疫印记检测ATO对HCK/STAT信号转导通路的影响。⑤建立32D/p210移植瘤模型，随机分为3组，ATO高、低剂量组分别给予ATO5、2．5 mg/kg/d，连续10天，腹腔注射；生理盐水组给予等体积的生理盐水，用法同ATO组。观察不同浓度ATO治疗组及对照组瘤块大小、抑瘤率，取瘤组织行病理学检查和瘤细胞超微结构观察，并对治疗后瘤组织的Bcr—Abl融合基因拷贝数进行测定。观察裸鼠一般状态的变化，并在光镜下观察裸鼠肝、肾结构的改变，同时对裸鼠进行治疗后血常规的检测。 结果：⑴所有患者均获得了稳定的完全血液学缓解，所需中位时间为4周。IM治疗6个月，80%患者获得了主要遗传学缓解，IM治疗12个月，所有患者均获得了主要遗传学缓解，获得主要遗传学缓解的中位时间为3个月。IM治疗6个月，55%的患者获得了完全遗传学缓解，IM治疗12个月，80%的患者获得了完全遗传学缓解。IM治疗12个月的完全分子生物学缓解率是20%。在观察期内，无1例患者出现血液学和遗传学复发，无1例耐药发生。对副作用的观察表明，IM与ATO联合应用在患者中有良好的耐受性。⑵建立了伊马替尼耐药患者ABLKD点突变的检测方法。IM耐药的CML患者ABLKD总的点突变检出率为45．45%。其中，血液学耐药患者ABLKD点突变检出率为57．14%。遗传学耐药患者ABLKD点突变检出率为25%。共发现3种点突变，G250E（2例）、E255K（1例）和T315I（2例）。血液学耐药的患者，发现突变的时间最早为IM治疗后4个月，最长为IM治疗后9个月。遗传学耐药患者突变检出时间是IM治疗后12个月。所有患者IM治疗前均未检出突变。⑶成功建立了IM耐药的CML细胞模型32Dp210T315I及32Dp210E255K，两细胞株Bcr—Abl融合基因拷贝数均较高，并表达Bcr—Abl融合蛋白。⑷IM对32D/MIG、32D/p210、32D/p210T315I及32D/p210E255K的IC50分别为>10μM、0．17±0．02μM、>10μM及3．31±6．40μM。而ATO对上述细胞株的IC50分别为0．58±0．03μM、0．35±0．05μM、0．38±0．04μM及0．41±0．06μM。两者以固定比例联合应用时，对32D/p210的联合应用指数分别为CI：IC50：1．10±0．07、CI：IC80：0．88±0．20，对32D/p210E255K的联合应用指数分别为CI：IC50：1．00±0．07、CI：IC80：0．90±0．31。ATO对32D/p210、32D/p210T315I及32D/p210E255K诱导的凋亡表现出时间．剂量依赖性。ATO作用于32D/p210、32D/p210T315I及32D/p210E255K48h时，对HCK/STAT途径有显著的抑制作用。⑸ATO高、低剂量组的瘤组织大小均较生理盐水组明显缩小；瘤组织病理可见ATO高剂量组以中度坏死为主，低剂量以轻度坏死为主。电镜下发现ATO高、低剂量组瘤组织的细胞出现凋亡。经治疗，Bcr—Abl融合基因拷贝数显著降低，高剂量组拷贝数的降低明显大于低剂量组（P<0．0001）。ATO高、低剂量组裸鼠一般状态良好，ATO无明显的肝、肾毒性，对血象也无明显影响。肾脏病理仅在高剂量组出现了轻微的肾小管上皮细胞水肿和灶性蛋白管型，仅轻微的降低了血红蛋白，且高剂量组降低的较为明显。 结论：①IM与ATO联合应用是一种有前途的治疗CML的方法。并有可能因ATO的引入而克服耐药的发生，且不增加IM的副作用，在患者中有良好的耐受性。②发生IM耐药的CML患者，其Bcr—Abl融合基因ABLKD存在着高频率的点突变，且与IM治疗相关。通过对耐药点突变情况进行早期检测，有利于在发生耐药前进行治疗干预，为患者提供更有效的治疗选择。③建立了IM耐药的CML细胞模型，为研究IM耐药的CML提供了新的有力工具。④IM对32D/p210T315I及32D/p210E255K耐药，ATO与IM无交叉耐药现象。ATO对Bcr—Abl阳性细胞株的治疗表现出靶向性。在IM自身能克服耐药的浓度下，ATO与IM对IM耐药的细胞株表现为相加或协同作用。ATO对IM耐药的CML细胞株的作用与其诱导凋亡和下调HCK/STAT信号转导通路有关。⑤32D/p210对裸鼠具有高致瘤性，ATO对该瘤有明显抑制作用，并能显著降低Bcr—Abl融合基因拷贝数，其作用呈明显的剂量依赖性，其作用机制与诱导凋亡有关。ATO对裸鼠的肝、肾和造血系统无明显的副作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分伊马替尼与亚砷酸联合应用治疗慢性粒细胞白血病的临床观察

第二部分伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病患者BCR-ABL基因ABL激酶区点突变的检测

第三部分伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病细胞模型的建立

第五部分慢性粒细胞白血病细胞株裸鼠皮下成瘤实验及亚砷酸对瘤株的抑制作用

附 图

结 论

参考文献

综 述：慢性粒细胞白血病靶向治疗药物实验研究进展

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