霍乱弧菌两类菌株甘露醇PTS基因簇功能研究及甘露醇发酵快慢机制探讨

摘要

目的：Ol群El Tor型霍乱弧菌流行株(主要为产毒株)和非流行株(主要为非产毒株)山梨醇和甘露醇发酵实验有明显差别。为研究这种差异，本研究中确定预测的Ol群El Tor型霍乱弧菌甘露醇磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转运酶系统(PTS)基因簇md产物转运甘露醇的功能；比较El Tor型霍乱弧菌的流行株(山梨醇和甘露醇慢发酵)与非流行株(山梨醇和甘露醇快发酵)两类菌株在甘露醇发酵试验中mtlCBA基因转录水平差异的普遍性，明确mtl基因簇中调节基因mtlR的调节作用，以探索两类菌株对甘露醇发酵快慢的机理。 方法：采用基因缺失、回补的方法，对霍乱弧菌mtl基因簇中推测结构基因mtlCBA和推测调节基因mtlR基因进行功能验证。扩大检测菌株数量，对10株快发酵菌株(非流行株)和10株慢发酵菌株(流行株)在甘露醇发酵过程中的生长曲线和发酵液pH值变化进行检测，用实时荧光定量PCR相对定量的方法、比较两类菌株mtl操纵子中mtlCBA基因转录水平在培养发酵过程中的差异。另外，利用海肾荧光素酶(Rluc)报告系统检测两类菌株中mtlCBA启动子活性的高低。利用pET蛋白表达载体系统对MtlR调控蛋白进行表达和纯化。 结果：慢发酵株N16961的mtlCBA缺失株N16961-dmtlCBA和快发酵株93097的mtlCBA缺失株93097-dmtlCBA在甘露醇作为唯一碳源的M9培养基中生长受限，在甘露醇发酵实验中不出现颜色转变，发酵反应转为阴性，而生长速度不受影响；慢发酵株N16961的mtlR缺失株N16961-dmtlR和快发酵株93097的mtlR缺失株93097-dmtlR在甘露醇发酵液及M9培养基中生长速度均比相应野生株略快，发酵反应也比相应野生株提前。随机选择10株慢发酵株(流行株)和10株快发酵株(非流行株)，测试甘露醇发酵过程中这些菌株mtlCBA转录水平的差异，比较发现早期(第1、2小时)显示快发酵株mtlCBA的mRNA转录水平高于流行株；而第4、8小时则相反。在甘露醇发酵试验第4小时(非流行株出现阳性反应)，被检测的多数快发酵菌株生长较慢发酵株迅速，但部分快发酵株生长浓度低于慢发酵株，但mtlCBA的mRNA转录水平仍高于慢发酵株。慢发酵株出现发酵阳性反应时(第8小时)生长浓度等于快发酵株。利用海肾荧光素酶(Rluc)检测两类菌株mtlCBA启动子活性，也显示整个甘露醇发酵试验过程中快发酵菌株的mtlCBA启动子区活性始终远高于慢发酵株的。研究中还表达纯化了带His标签的负调控蛋白MtlR以用于对其调控作用的进一步研究。 结论：霍乱弧菌甘露醇PTS操纵子中结构基因mtlCBA负责将底物由胞外转运入胞内。调控基因mtlR表达转录调节蛋白，对mECBA结构基因的转录起抑制作用，但不是引起快慢发酵株发酵差异的直接原因。霍乱弧菌两类菌株甘露醇发酵试验中甘露醇PTS操纵子转录差异、启动子活性高低应是流行株和非流行株发酵差异的原因。我们的研究提示在流行株(慢发酵株)和非流行株(快发酵株)中有其它的调控因素、通过不同的作用机制作用于序列相同的mtlCBA启动子区，使之对启动mdCBA转录的作用表现有强弱差别，造成流行株和非流行株的甘露醇发酵差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引言

第一部分霍乱弧菌甘露醇PTS操纵子相关基因功能确证

材料和方法

结果

第二部分霍乱弧菌甘露醇快慢发酵菌株mtlCBA转录水平的差异

材料和方法

结果

第三部分霍乱弧菌甘露醇PTS操纵子中转录调控基因mtlR的作用

材料和方法

结果

第四部分MtlR转录调控蛋白的表达和纯化

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附注

综述　实时荧光定量PCR技术MRNA定量分析研究进展

攻读学位期间发表的文章

致谢