耐热超氧化物歧化酶基因的克隆表达及蛋白的纯化、相关酶学性质研究

摘要

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一种广泛存在于动一植物和微生物中的金属酶。它催化超氧化物阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，从而清除O2-，在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起着重要的作用。根据结合的金属离子不同，超氧化物歧化酶分为三类：第一类是Cu,Zn-SOD，第二类能与Fe2+或Mn2+或者两者中的任意一个都能结合，即Fe-SOD，Mn-SOD或Fe/Mn-SOD，第三类是Ni-SOD。 我们从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)的菌株中克隆得到三种sod基因，Fe/Mn-sod，Mn-sod和Cu/Zn-sod。分析表明三种SOD分别与Geobacillus kaustophilus HAT426菌株相应的SOD序列同源性最高。克隆这三个基因到毕赤酵母表达载体pPIC9中，电击转化宿主菌GS115，发现一株有微弱表达。克隆Mn-sod基因到原核表达载体pET-28a中，转化大肠杆菌BL21菌株，蛋白表达量很高。蛋白纯化后比活达2726.7U/mg。该酶在60 ℃高度稳定，80℃作用2.5个小时仍有70％的活力，90℃作用2.5个小时还有30％的活力。离子重组实验表明Mn2+对维持酶的活性非常重要。根据活性和非活性SDS-PAGE试验的结果，推测此酶为同型四聚体结构。 为获得东方粘虫颗粒体病毒(Pseudelatia separata granulovirus,PsGV)基因组序列，本实验室采用随机克隆方法，建立了PsGV的质粒基因文库。通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析，获得了编码超氧化物歧化酶蛋白的基因(PsGV-sod)。该基因阅读框为462bp,共编码153个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性比较结果表明该基因与其他颗粒体病毒同源性较高，通过保守基序分析，认为其是铜锌超氧化物歧化酶。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1SOD的概念

1.1.1 SOD的作用机理

1.1.2 SOD的分类

1.1.3 SOD的来源

1.1.4 SOD的酶活测定方法

1.1.5 SOD的分子结构

1.1.6 SOD的应用

1.2超氧化物歧化酶的研究进展与研究意义

1.2.1超氧化物歧化酶的研究进展

1.2.2超氧化物歧化酶的研究意义

1.3耐高温酶的研究意义及进展

1.4杆状病毒基因组的研究

1.4.1杆状病毒的概念及分类

1.4.2杆状病毒的研究意义

第二章Geobacillus sp.POT5菌株的超氧化物歧化酶基因的克隆

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2酶和试剂

2.1.3培养基

2.1.4常用溶液和缓冲液的配制

2.2方法

2.2.1 sod基因片段的扩增

2.2.2碱法少量快速抽提质粒DNA

2.2.3双酶切

2.2.4 DNA片段的回收

2.2.5 连接

2.2.6制备感受态细胞

2.2.7转化

2.2.8筛选重组子

2.2.9序列测定及分析

2.3结果

2.3.1 sod基因片段的扩增

2.3.2 sod基因序列测定及编码序列分析

2.3.3 SOD蛋白序列的同源性比较分析

2.4讨论

第三章Geobacillus sp.POT5菌株sod基因在毕赤酵母中的表达

3.1材料

3.1.1菌株和质粒

3.1.2酶和试剂

3.1.3培养基

3.1.4 SDS-PAGE电泳试剂的配制

3.1.5主要仪器

3.2方法

3.2.1真核重组表达载体的构建

3.2.2酵母感受态的制备

3.2.3 转化

3.2.4转化子的筛选

3.2.5目的蛋白在毕赤酵母中的检测

3.3结果

3.3.1真核表达质粒的构建与鉴定

3.3.2目的基因在毕赤酵母中的表达

3.4讨论

第四章Geobacillus sp.POT5菌株锰sod基因在大肠杆菌中的表达，纯化及相关性质的研究

4.1材料

4.1.1菌株和质粒

4.1.2酶和试剂

4.1.3缓冲液

4.1.4主要仪器

4.2方法

4.2.1原核重组表达载体的构建

4.2.2感受态的制备和转化

4.2.3目的基因在大肠杆菌中的表达检测

4.2.4目的蛋白锰SOD的纯化

4.2.5锰SOD蛋白活性分析

4.2.6锰SOD蛋白金属离子分析

4.2.7锰SOD蛋白稳定性试验

4.2.8锰SOD蛋白分子结构预测

4.3结果

4.3.1重组表达载体的构建与鉴定

4.3.2目的基因表达结果

4.3.3锰SOD的纯化结果

4.3.4锰SOD蛋白活性分析

4.3.5锰SOD蛋白金属离子分析

4.3.6锰SOD蛋白稳定性试验结果

4.3.7锰SOD蛋白分子单体三维结构预测

4.4讨论

第五章东方粘虫颗粒体病毒sod基因的克隆与分析

5.1材料

5.1.1菌株和质粒

5.1.2酶和试剂

5.2方法

5.2.1 PsGV基因组DNA的制备

5.2.2基因组序列随机克隆

5.2.3 sod基因核苷酸及其编码氨基酸序列分析及分子系统学分析

5.3结果

5.3.1 sod基因序列分析

5.3.2核苷酸序列同源性比较结果

5.3.3氨基酸序列同源性分析

5.4 讨论

结论

1结论

2未来需要解决的问题

参考文献

附录 sod基因表达载体构建的简易流程图

硕士期间公开发表的论文

致谢