Ang-1或/和VEGF165转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及分子机制研究

摘要

目的：研究腺病毒介导的人血管生成素-1(Ad-Ang-1)或/和血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成活性及其分子机制。 方法：以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板PCR扩增人VEGF165基因片段，同时抽取人骨髓细胞总RNA，经RT-PCR克隆出人Ang-1基因片段，分别将其亚克隆至本室改建的pAdTrack-CMV-IRES重组转移质粒中经PCR、双酶切和DNA测序鉴定后，将上述构建正确的重组转移质粒用Pme I酶切线性化后分别与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，得到的重组腺病毒质粒经Pac I酶切后再用脂质体分别转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞(293A)，经多轮感染和扩增后获得Ad-IRES空载体腺病毒、Ad-VEGF165单基因重组腺病毒、Ad-Ang-1单基因重组腺病毒和Ad-Ang-1-VEGF165双基因共表达重组腺病毒，经效价测定后分别感染在丝素膜等不同材料上培养的293A细胞，观察其形态学改变并用EIASA法检测目的基因的表达。同时开展下列功能实验：(1)ELISA法检测Ang-1或/和VEGF165单、双基因重组腺病毒对WI-38人胚肺成纤维细胞血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血小板衍化生长因子(PDGF)表达的影响；基因芯片法检测再生丝素膜对Ad-Ang-1-VEGF165双基因共表达重组腺病毒修饰的WI-38细胞基因表达谱的影响。(2)将Ang-1或/和VEGF165转基因WI-38细胞修饰的丝素材料进行鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)。(3)建立大鼠背部皮肤全层切割伤模型，按下列4组：再生丝素膜(SF)组、再生丝素膜+MSC细胞(SFMSC)组、再生丝素膜+MSC细胞+Ad-Ang-1-VEGF(SFMSCAV)组及空白对照(PBS)组开展了组织损伤修复试验，通过创伤组织大体观察和病理组织学检测来研究Ad-Ang-1-VEGF165转基因细胞修饰的再生丝素膜对皮肤创伤的治疗作用。 结果：以pcDNA3.0-VEGF165质粒和人骨髓细胞总RNA逆转录合成的cDNA为模板PCR分别扩增出576bp的人VEGF165和1497bp的人Ang-1目的基因片段，亚克隆的VEGF165和Ang-1基因片段的序列测定结果与GenBank报道的完全一致，成功构建了pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES和pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165重组质粒，并成功获得了Ad-VEGF165、Ad-Ang-1单基因腺病毒载体和Ad-Ang-1-VEGF165双基因共表达重组腺病毒载体。ELISA法证实上述各组腺病毒载体均能在再生丝素膜上生长的293A细胞中成功表达目的基因Ang-1、VEGF。同时，再生丝素膜对Ang-1或/和VEGF165转基因的WI-38成纤维细胞不仅有利于与血管形成相关的Ang-1或/和VEGF目的基因的高表达，而且也有利于WI-38细胞自身分泌的与组织损伤修复相关的FGF-2、PDGF的稳定表达。基因芯片结果表明再生丝素膜不仅有利于WI-38成纤维细胞黏附、生长相关基因的表达，而且对Ad-Ang-1-VEGF165双基因共表达腺病毒载体转基因WI-38细胞又可增强其血管形成和组织修复相关基因的表达。CAM实验表明Ang-1或/和VEGF165转基因WI-38细胞修饰的再生丝素膜具有促进CAM上血管生成的活性，并通过大鼠创伤修复实验进一步证明Ad-Ang-1-VEGF165转基因骨髓基质细胞修饰的丝素材料还可促进创伤组织的血管生成，从而有利于其恢复。 结论：成功构建了腺病毒介导的Ang-1或/和VEGF165基因表达载体，再生丝素膜不仅利于与血管形成有关的目的基因Ang-1、VEGF在成纤维细胞中呈现高效表达，而且也能维持或促进成纤维细胞自身分泌的与血管新生和组织损伤修复相关基因的表达。通过Ang-1或/和VEGF165转基因细胞修饰后的再生丝素膜具有诱导血管生成的活性。进而为再生丝素膜经转基因细胞修饰后具有诱导血管生成效应提供了实验依据，此外还为今后进一步采用转基因技术对生物材料进行修饰或改性，研制出具血管诱导性的医用生物材料创造了条件。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

第一部分 腺病毒介导的VEGF165和/或Ang-1载体的构建和鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分 Ad-VEGFl65转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分 Ad-Ang-1转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四部分 Ad-Ang-1-VEGF165转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

结论

综述：皮肤组织诱导性的医用生物材料的研究进展

攻读硕士学位期间发表和待发表的论文

附 图

致谢