家蚕核型多角体病毒基因gp41及da26的融合表达

摘要

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrin virus，BmNPV)是杆状病毒中研究较为深入的一种病毒，在BmNPV的生活周期中，产生两种病毒形态包涵体病毒(Occluded virus，OV)和芽生型病毒(Budded virus，BV)，这两种病毒形态在病毒致病机理上起着不同的作用。BV和OV虽然在遗传学上相同，但组成其囊膜的脂质和蛋白质不同，这对各自的组织定向性具有重要性。gp41基因是目前已获得全基因组的杆状病毒中都保守存在的基因，其蛋白产物GP41仅存在于ODV中，并定位于包涵体病毒囊膜和核衣壳之间。da26基因不保守，只存在于几种杆状病毒中，其蛋白产物BV/ODV-E26(E26)为囊膜蛋白，同时存在于BV和ODV中。gp41和da26是BmNPV中与病毒结构有关的基因。为了更深入的了解gp41和da26基因在BmNPV中的结构与功能，我们就gp41和da26基因在家蚕BmN细胞中的表达特征及相关功能开展了研究，主要研究结果如下：
　　 为了研究BmNPV中GP41蛋白的包装功能，从BmNPV基因组中克隆了gp41基因，并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-GFP中，构建重组转移载体pFastBac1-gp41-GFP；利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒，在家蚕细胞系BmN中进行了融合表达和定位研究。SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示，融合蛋白的大小为65kD左右，证明该融合蛋白在BmN中成功表达。荧光显微镜的观察表明，绿色荧光充满在细胞质中，不能形成聚集体；与野生型BmNPV混合感染的实验也表明，荧光出现的位置与多角体无关，说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面，融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。
　　 启动子polh的调控下，DA26蛋白的表达研究。我们从BmNPV基因组中克隆了da26基因，并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl-GFP中，构建重组转移载体pFastBacl-da26-GFP；利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒，在家蚕细胞系BmN中进行了融合表达。荧光显微镜观察发现融合蛋白DA26-GFP在细胞中呈颗粒状分布，单个细胞中颗粒数不等。由于DA26蛋白具有易被洗脱剂或去污剂洗脱的特点，根据此特征，我们对DA26蛋白进行了纯化。将纯化的DA26-GFP蛋白进行SDS-PAGE，发现一些与DA26蛋白相关的蛋白条带。将感兴趣的条带进行质谱分析得出其相应基因为vp39和bro-like。推测BmNPV DA26基因可能与bro-like，VP39及肌动蛋白形成复合物，参与与病毒复制或蛋白水解等有关的活动。
　　 近年来，对BmNPV的分子生物学研究倍受重视，并取得了迅速的发展，但BmNPV大多数基因的功能都是根据苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒同源基因的功能推断而来，到目前为止确定功能的基因只有少数。gp41和da26基因是与病毒结构有关的基因，该种基因决定了病毒入侵宿主细胞的方式和能力，对病毒的繁殖有着重要的作用。这两种基因在AcMNPV中研究最多，而在BmNPV中的研究很少，而且gp41和da26基因对应的蛋白产物GP41及BV/ODV-E26(E26)的功能目前还未知。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，BmNPV作为杆状病毒研究的最为深入的病毒之一，加深对gp41和da26基因的研究不论对基础研究还是实际生产都具有重要的意义。