蛇床子素(osthole)对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究

摘要

第一章蛇床子素抗肝细胞肝癌作用的研究
　　目的：研究蛇床子素抗肝癌作用及其特点。
　　方法：采用MTT方法和流式细胞术观察蛇床子素对体外培养肝癌细胞株增殖、凋亡和周期的影响；应用SMMC-7721裸鼠肝癌模型和Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型观察蛇床子素在体的抗肝癌效应和毒性，及其在肝癌小鼠体内的吸收和分布研究。
　　结果：
　　1）蛇床子素对人肝癌细胞SK-HEP-1、SMMC-7721和HepG-2，小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖均有抑制作用，且有剂量和时间依赖关系；也可抑制正常肝细胞的增殖，但其IC50高于四株肝癌细胞，表现为其细胞毒性是有选择性的。
　　2）蛇床子素可诱导人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠肝癌细胞Hepa1-6的凋亡，对周期进程阻滞在G2期。
　　3）蛇床子素可抑制裸鼠和C57小鼠肝癌模型的肿瘤生长，腹腔注射给药方式优于口服灌胃。
　　4）蛇床子素可以进入肝癌小鼠血流较丰富的组织（包括肿瘤），其转运机制主要为简单的被动扩散。
　　结论：蛇床子素是一种低毒、具有抗肝癌效应的天然化合物。
　　第二章蛇床子素诱导肝细胞肝癌凋亡机制的研究
　　目的：阐明蛇床子素诱导肝癌细胞凋亡的机制。
　　方法：应用Real-time PCR方法观察蛇床子素对凋亡相关84个基因表达的影响；采用western blot和EMSA技术观察蛇床子素对Bax、Bcl-2、Caspase、PARP、CyclinB、NF-κB蛋白水平以及PI3K/Akt通路调节的影响；并采用MTT法观察蛇床子素与Trail联合用药对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响。
　　结果：
　　1）蛇床子素可以使28个凋亡相关因子表达升高，其中TNF受体（占21.43%）和TNF配体（占17.86%）家族所占比例最高。
　　2）蛇床子素可以上调肝癌细胞中Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，使Bax/Bcl-2的比值增高；促进Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化，PARP蛋白酶的剪切；下调周期蛋白Cyclin B1的表达。
　　3）蛇床子素可抑制肝癌细胞中NF-κB的活化，有时间和剂量依赖性。
　　4）蛇床子素对肝癌细胞中总Akt表达无影响，可下调磷酸化Akt和PI3K二个亚基（p110和p85）蛋白的表达。胰岛素可以减弱蛇床子素对磷酸化Akt和PI3K p110亚基蛋白表达的下调，而LY294002可增强其下调作用。
　　5）蛇床子素可增强TRAIL对SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制，但随着蛇床子素浓度的增加，其增强作用逐渐减弱。
　　结论：蛇床子素诱导凋亡的机制是多靶点和多通路；可能作用于与TRAIL相同的靶点，其机制为通过抑制PI3K/Akt通路的激活，从而抑制NF-κB的活化，下调周期蛋白CyclinB，阻滞细胞在G2/M期；同时可以上调Bax蛋白表达，激活Caspase-9；并通过死亡结构受体激活Caspase-8，继而激活Caspase-3，促进PARP的剪切，从而诱导肝癌细胞凋亡。
　　第三章蛇床子素对抗肿瘤免疫功能的增强效应
　　目的：研究蛇床子素对肝癌小鼠免疫系统的影响，进一步从免疫增强角度探讨蛇床子素抗肝癌的作用机制。
　　方法：采用MTT法观察蛇床子素对体外培养脾淋巴细胞增殖的影响；应用Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型，采用流式细胞术测定小鼠脾脏中各淋巴细胞亚群和ELISA法测定血清中IL-2、TNF-α水平，观察蛇床子素对小鼠抗肝癌免疫反应的影响。
　　结果：
　　1）低浓度的蛇床子素可以促进未刺激和ConA、LPS刺激下小鼠脾淋巴细胞的增殖。
　　2）蛇床子素对肝癌小鼠的胸腺重量和胸腺指数无影响，对脾脏重量和脾脏指数有增高趋势。
　　3）蛇床子素对肝癌小鼠脾脏中B细胞的比例和数量，及其活化和成熟均无影响；有升高巨噬细胞、CD4+T和CD8+T细胞的比例和数量的趋势，对CD4+/CD8+比值保持在正常水平，并可提高肿瘤组织中CD4+T和CD8+T细胞的比例。
　　4）蛇床子素可以促进肝癌小鼠脾脏中CD4+T和CD8+T细胞的活化，提高CD8+效应型T细胞的比例。
　　5）蛇床子素可降低肝癌小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例。
　　6）蛇床子素可以增高肝癌小鼠血清中IL-2和TNF-α水平。
　　结论：蛇床子素具有增强肝癌小鼠抗肿瘤免疫反应的作用。

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引言

第一章 蛇床子素抗肝细胞肝癌作用的研究

1 材料和方法

2 实验结果

第二章 蛇床子素诱导肝细胞肝癌凋亡机制的研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 蛇床子素对抗肿瘤免疫功能的增强效应

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

结论

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

附录1 Top maps

附录2 主要试剂溶液配制方法

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