OX40/OX40L分子在B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠免疫病理中的作用机制

摘要

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种综合性的系统性自身免疫病，以产生大量自身抗体形成免疫复合物沉积于各组织器官并导致其严重损伤为特征，同时伴有慢性炎症，但致病机制尚不清楚。B6.MRL-Faslpr/J（简称B6. Fas）狼疮小鼠是一种以lpr基因突变导致Fas分子缺陷，从而出现异常T细胞增殖、淋巴结增生、脾肿大、大量抗DNA抗体和肾小球肾炎为特征的SLE动物模型，因其发病症状与人类SLE相似，近年来被广泛用于SLE发病机制以及病情发展相关的研究。
　　OX40/OX40L是一对重要的协同刺激分子，属于TNFR/TNF超家族，OX40主要表达于活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞上，OX40L表达于活化的抗原提呈细胞，如树突状细胞（DC）、B细胞等，该信号在T细胞的活化、增值以及抑制凋亡过程中发挥着至关重要的作用。近年来的研究发现，SLE患者的外周血中CD4+T细胞上OX40的表达量明显高于健康人，在狼疮性肾炎患者的肾脏活组织切片检测中，则发现大量OX40L的表达，因此推测，OX40/OX40L与SLE的发生、发展有着密不可分的关系。
　　本研究以B6. Fas狼疮小鼠为SLE模型，采用流式细胞术检测其脾脏T细胞和抗原提呈细胞上OX40和OX40L表达，旨在通过动物疾病模型探讨OX40/OX40L信号在SLE发病机制中的作用。
　　第一部分：OX40和OX40L分子在不同病理阶段B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏中的表达及意义
　　【目的】检测B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏组织中CD4+T、CD8+T细胞，以及CD19+B细胞、CD11b+细胞上OX40和OX40L的表达，分析其与SLE发病的相关性。
　　【方法】实验组为B6. Fas狼疮小鼠12只，按周龄分为三组（12周、20周、28周），每组4只；对照组为C57BL/6J小鼠12只，同样按周龄分为三组（12周、20周、28周）每组4只。为了分析小鼠肾脏损伤程度，采用Albustix试纸法检测小鼠24h尿蛋白量；采用HE染色的方法检测肾脏血管周围淋巴细胞浸润；通过荧光染色检测IgG沉积。并利用流式细胞仪检测技术对小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞以及CD19+B细胞、CD11b+细胞上OX40/OX40L的表达水平进行分析；另外，采用免疫组化检测小鼠肾脏组织中OX40和OX40L的表达；统计学方法分析不同组间OX40/OX40L分子表达的差异；检测数据用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验分析，p<0.05为差异具有统计学意义。图表利用GraphPad Prism5.0软件绘制。
　　【结果】（1）实验组20周龄小鼠伴有异常升高的蛋白尿（++~+++）、28周龄小鼠蛋白尿含量进一步升高为++++，实验组12周龄及对照组均为≦+。（2）对照组和实验组12周龄小鼠的肾脏中基本无IgG沉积，血管周围也无明显淋巴细胞浸润，随着周龄增加IgG沉积愈明显，浸润的淋巴细胞数量也逐渐增多，28周龄小鼠IgG沉积量最多，肾脏血管周围淋巴细胞浸润程度最严重，达到3级。（3）与对照组相比，实验组12周龄小鼠T细胞上OX40/OX40L的表达无显著上调。实验组20周、28周龄小鼠CD4+T细胞上OX40和OX40L表达水平以及共表达率明显升高，CD8+T细胞上OX40表达水平无显著差异，OX40L表达水平有一定程度的异常升高；并且实验组28周龄小鼠T细胞上OX40/OX40L的表达水平高于实验组20周龄小鼠。（4）与对照组相比，实验组12周龄小鼠抗原提呈细胞上OX40L的表达无显著上调。实验组20周、28周龄小鼠 CD19+B细胞、CD11b+细胞上OX40L的表达水平则明显升高；并且实验组28周龄小鼠抗原提呈细胞上OX40L的表达水平高于实验组20周龄小鼠。（5）对照组和实验组12周龄B6.Fas狼疮小鼠肾脏组织基本没有OX40和OX40L的表达，而20周龄B6.Fas狼疮小鼠肾脏组织中则呈现明显的OX40和OX40L的表达，28周龄表达水平更高，而且OX40和OX40L几乎都表达在肾小球内部和周围浸润的淋巴细胞上。
　　【结论】狼疮小鼠随着周龄增加，肾脏病理损伤愈严重，狼疮小鼠脾脏 T细胞和抗原提呈细胞上以及肾脏组织中OX40/OX40L分子表达水平逐渐上调表达，表明OX40/OX40L表达水平与狼疮的病情严重程度，特别是肾脏损伤密切相关。由此提示OX40/OX40L协同刺激信号可能参与了SLE病免疫病理过程，B细胞和CD11b+细胞作为抗原提呈细胞与T细胞相互作用，传递OX40正向信号，促进T细胞异常活化、增殖，并介导其长期存活。同时表达OX40L的CD4+和CD8+T细胞作为抗原提呈细胞也能与表达OX40的自身或邻近CD4+T细胞结合，进一步放大T细胞的活化扩增效应，而T细胞持续活化正是SLE病情进展的重要环节；另外，B细胞上OX40L有可能传递逆向信号，导致B细胞功能亢进，异常活化，同时在活化的 T细胞辅助下，分泌大量自身抗体，从而导致狼疮的发生、发展。因此，靶向OX40/OX40L可能为诊断和治疗SLE提供新思路。
　　第二部分：B6. MRL-Faslpr/J狼疮小鼠中表达OX40和OX40L的CD4+T细胞的生物学特性
　　【目的】检测B6. MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏组织中表达OX40和/或OX40L的CD4+ T细胞上CD25、PD-1、ICOS和CXCR5的表达，以及CD44和CD62L的表达，同时检测CD4+T细胞中各亚群胞内细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17等的表达，以鉴定表达 OX40和OX40L的CD4+ T细胞的生物学特性，初步探讨OX40/OX40L在狼疮小鼠发病过程中的作用和机制。
　　【方法】采用流式细胞仪检测技术检测小鼠脾脏CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L－、CD4+OX40－OX40L+、CD4+OX40－OX40L－四群T细胞上CD25、PD-1、ICOS和CXCR5的表达，以及CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L－、CD4+OX40－OX40L+三群T细胞上CD44和CD62L的表达；采用胞内染色法检测CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L－、CD4+OX40－OX40L+四群T细胞上IFN-γ、IL-4、IL-17的表达。用统计学方法分析不同组间表达的差异。检测数据用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验分析，P<0.05为差异具有统计学意义。图表利用GraphPad Prism5.0软件绘制。
　　【结果】（1）CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L－T细胞亚群上CD25、PD-1和ICOS表达水平均显著高于CD4+OX40－OX40L+、CD4+OX40－OX40L－T细胞亚群，且 CD4+ OX40+ OX40L+、CD4+OX40+OX40L－ T细胞亚群为PD-1highICOShigh，而 CD4+ OX40－OX40L+、CD4+OX40－OX40L－T细胞亚群为PD-1lowICOSlow。与不表达OX40的T细胞相比，表达OX40的T细胞上CXCR5表达更高，而且 CXCR5high比例也更高。（2） CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L-T细胞亚群为CD44highCD62Llow；CD4+OX40－OX40L+T细胞亚群为CD44highCD62Lhigh。（3）与CD4+OX40-OX40L-T、CD4+OX40-OX40L+T细胞亚群相比，CD4+OX40+OX40L+、CD4+OX40+OX40L-T细胞亚群上IFN-γ、IL-17表达均明显下降，而IL-4则呈高水平表达，无明显下调。
　　【结论】CD25在仅表达OX40和共表达OX40/OX40L的这两群CD4+ T细胞上高表达，说明这两群T细胞呈现异常活化状态，同时表达CXCR5、PD-1和ICOS，且为CXCR5high PD-1high ICOShigh，另外这两群CD4+T细胞均低水平表达IFN-γ、IL-17，而高水平表达IL-4，说明这两群表达OX40的CD4+T细胞可能是Tfh。仅表达OX40和OX40、OX40L共表达的两群CD4+T细胞上，还呈现效应性记忆T细胞表型，符合Tfh表型特点。表达在Tfh上的OX40和OX40L可能有助于其持续扩增，从而促进B细胞异常分泌抗体，在SLE免疫病理机制中发挥重要的作用。而仅表达OX40L的CD4+T细胞则呈现中枢记忆T细胞表型，因此，这几群细胞可能通过不同的方式参与SLE的免疫病理过程。

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研究背景

一、OX40和OX40L的生物学特性

二、OX40/OX40L双向协同刺激信号的转导

三、OX40/OX40L信号在免疫应答中的作用及其意义

四、OX40/OX40L信号与自身免疫疾病

五、SLE小鼠模型

第一部分 OX40和OX40L分子在不同病理阶段B6. MRL-Faslpr/J狼疮小鼠中的表达及意义

一、试剂与材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分 B6. MRL-Faslpr/J狼疮小鼠中表达OX40和OX40L的CD4+T细胞的生物学特性

一、试剂与材料1. 研究对象

二、实验方法

三、实验结果

参考文献

结论与展望

全文总结：

展望：

综述

硕士学位学习期间发表的论文

本课题的受资助情况

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