人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定及PI3K/AKT信号传导通路对其增殖及自我更新的影响

摘要

第一部分PI3K/AKT信号传导通路蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
　　目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。
　　方法:回顾性分析157例NSCLC患者的临床资料,其中鳞癌75例,腺癌82例,Ⅰ-ⅢA期70例,ⅢB-Ⅳ期87例,并收集30例手术切除肺癌癌旁组织标本。应用免疫组织化学方法检测PI3K和p-AKT蛋白在NSCLC癌组织和手术切除的肺癌癌旁组织中的表达,分析PI3K和p-AKT蛋白表达与NSCLC患者临床资料变量的关系,同时分析PI3K和p-AKT蛋白表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC预后的关系。
　　结果:PI3K和p-AKT在Ⅰ-ⅢA期NSCLC中的表达明显高于癌旁组织(χ2=14.8455,P=0.000;χ2=14.2615,P=0.000)。p-AKT表达与Ⅰ-ⅢA期NSCLC的淋巴结转移、TNM分期呈正相关(χ2=6.1189,P=0.013,χ2=8.9752,P=0.011),而与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度无关。p-AKT表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC的TNM分期呈正相关(χ2=5.7501,P=0.016),与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度、体力状态(PS)评分无关。PI3K表达与上述临床特征无关。在ⅢB-Ⅳ期NSCLC中,PI3K阴性表达组的中位数生存时间明显优于阳性表达组[17.699月(95％CI15.114-20.283)/13.426月(95%CI11.832-15.021),P=0.004],p-AKT阴性表达组的中位数生存时间明显亦优于阳性表达组[17.134月(95%CI14.927-19.341)/13.067月(95%CI11.316-14.817),P=0.007]。多变量Cox’s回归分析显示PI3K[HR=2.143(95%CI1.211-3.790),P=0.009],p-AKT[HR=1.991(95%CI1.009-3.927),P=0.047],TNM分期[HR=4.788(95%CI2.591-8.848),P=0.000],PS评分[HR=3.272(95%CI1.701-6.296),P=0.000]是ⅢB-Ⅳ期NSCLC的独立不利预后因素。
　　结论:p-AKT与NSCLC不良预后因素密切相关,PI3K、p-AKT的高表达是晚期NSCLC预后的独立不利因素。
　　第二部分人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定
　　目的:从人肺腺癌组织中分离、培养及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性类肺癌干细胞。
　　方法:采用磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)技术从人肺腺癌组织单细胞悬液中分离CD133阳性细胞,无血清培养基富集CD133阳性细胞,流式细胞仪及免疫荧光检测富集后细胞的CD133的表达,并通过NOD/SCID小鼠移植评估其致瘤性。
　　结果:人肺腺癌组织CD133阳性细胞成功分离,无血清培养法可用于分离的CD133阳性细胞的培养及富集,其具有自我更新,多项分化及高致瘤能力,在NOD/SCID小鼠中仅需移植100个细胞即可形成肿瘤。
　　结论:MACS联用无血清培养法是人类肺癌干细胞分离和富集的有效方法。
　　第三部分SiRNA沉默AKTl、PI3KP85基因对肺癌干细胞增殖及自我更新的影响
　　目的:探讨RNAi(RNA interference)技术下调肺癌干细胞中AKTl和PI3KP85亚基的表达对肺癌干细胞增殖和自我更新的影响。
　　方法:实时荧光定量PCR检测肺癌干细胞中AKTl和PI3KP85mRNA的表达。将包含AKT1、PI3KP85两种siRNA开放阅读框的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3KP85转染至肺癌干细胞中。应用Western blotting检测转染后目的基因蛋白的表达水平,并用Western blotting检测目的基因被沉默后PCNA、cyclin D1和P53的表达情况。分别采用MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验观察各组差异,并用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。
　　结果:肺癌干细胞AKT1和PI3KP85亚基的mRNA表达明显高于肺癌原代细胞,重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3K P85介导的靶向AKTl,PI3KP85shRNA可以有效下调目的基因AKT1和PI3KP85的蛋白表达;下游相关因子PCNA、cyclin D1的表达亦下调,P53表达则上调。MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验发现肺癌干细胞增殖、自我更新、体外致瘤能力都显著降低。
　　结论:AKTl和PI3K P85基因在肺癌干细胞高表达,靶向AKTl/PI3KP85亚基的shRNA技术可以抑制肺癌干细胞中AKTl、PI3K P85亚基的表达,抑制肺癌干细胞的体外增殖及自我更新能力。

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封面

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英文摘要

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前言

第一部分：PI3K/AKT信号传导通路蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

材料与方法

结果

讨论

附图表

第二部分：人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定

材料和方法

结果

讨论

附图表

第三部分：SiRNA沉默AKTl、PI3K P85基因对肺癌干细胞增殖及自我更新的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述

中英文缩写对照

攻读学位期间公开发表的论文

致谢