EGFR基因缺失突变检测新技术及其应用于游离DNA检测的可行性

摘要

目的:评估分子开关技术在Real-time qPCR平台检测EGFR基因19外显子delE746-A750和del L747-S752 ins S缺失突变的敏感性和特异性，探讨蓝白斑筛选技术在EGFR基因19外显子EGFR基因19外显子检测的新应用，并评估Blocker引物联合蓝白斑筛选技术和分子开关技术在游离DNA中检测EGFR基因19外显子缺失突变的可行性。
　　方法:根据EGFR基因19外显子del E746-A750和del L747-S752 ins S缺失突变，即15碱基和18碱基缺失突变为检测靶点，分别设计3'末端与突变基因位点配对的引物，并硫化磷酸修饰;采用高保真DNA聚合酶联合3'末端硫代修饰的特异性引物所构成的分子开关技术，在Real-time qPCR平台对含有相应缺失突变的质粒模板、正常人基因组DNA模板及基因组混合突变质粒模板进行敏感性和相关性的分析和方法评估。对24例肺癌患者的游离DNA样品进行了分子开关技术的筛查。
　　设计一组特异性PCR引物，以样本DNA（包括EGFR野生型、突变型质粒、血基因组DNA、外周血游离DNA等）为模板进行插入片段的PCR扩增，通过改变阅读框架序列，致使野生型阅读框架中含有终止密码子TAA，缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子TAA，结合蓝白斑筛选，以菌落的颜色来确定样品有无EGFR基因19外显子的缺失突变。
　　设计与EGFR基因19外显子野生型序列配对，其3'末端引入一个间臂，以阻止3'端聚合酶引发聚合反应的Blocker引物。将Blocker引物分别联合分子开关技术和蓝白斑筛选技术，评估此类优化方法在游离DNA样品中检测突变的检出率。
　　结论:高保真DNA聚合酶介导的硫化修饰特异性引物构建的分子开关技术，在Real-time qPCR平台建立了识别EGFR基因19外显子15碱基和18碱基缺失突变的高敏感性和特异性好的qPCR技术，并在拷贝数较低的血浆游离DNA样品中检测到了上述稀有突变。此项技术对临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，监测肿瘤的预后具有一定的实际应用价值。
　　通过PCR技术改变插入片段序列，使蓝白斑筛选技术可用于检测EGFR基因19外显子15碱基和18碱基缺失突变。在不同模板中包括质粒DNA、血基因组DNA及混有不同浓度的突变质粒的基因组DNA中，评估了蓝白斑筛选技术在上述缺失突变检测中的高敏感性和特异性。
　　Blocker引物结合蓝白斑筛选技术和分子开关技术，可提高此两类方法的特异性，有效降低可能由野生模板产生的假阳性结果，Blocker引物的联合使用可将蓝白斑筛选技术和分子开关技术应用于低拷贝数的游离DNA样品中的突变检测，为无创性诊断肺癌患者EGFR基因外显子19的缺失突变，及监测个体化用药提供思路。