靶向MUC1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞杀伤肝癌细胞的研究

摘要

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由一个scFv(single chain variablefragment)单链抗体可变区片段（由抗体VH氨基酸序列和VL区氨基酸序列经Linker连接而成），通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和胞内信号结构域(源CD3ζ/FcεRIγ免疫受体酪氨酸活化基序、源自CD28/4-1BB/OX40/ICOS/DAP10/LCK共刺激信号分子胞内结构域）连接构成。经CAR遗传修饰的T细胞（简称CAR-T），能够高效识别和杀伤由于MHC分子或抗原加工相关蛋白酶体低表达、逃逸TCR介导免疫反应的肿瘤细胞。 MUC1（Mucin1，黏蛋白1）是一种大分子跨膜糖蛋白，广泛高表达于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤，它的胞外区主要由20个氨基酸（PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA）的核心重复序列组成，是MUC1蛋白糖基化修饰位点，且相对于正常细胞，肿瘤细胞表面MUC1具有不同的糖基化结构。过表达和糖基化异常都使MUC1成为各种免疫治疗的理想靶点。 本课题中我们以MUC1作为免疫靶点，分别构建第一代与第三代靶向MUC1的CAR基因表达框（MUC1-CAR和G3MUC1-CAR），并将其装入慢病毒载体，利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞，通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验，分别检测在MUC1抗原存在条件下，CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。 实验中我们成功构建两种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框、重组慢病毒、Jurkat CAR-T细胞株。两种经MUC1嵌合抗原受体修饰的Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子，杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701，而对MUC1低表达的正常肝细胞L02基本不杀伤;相对于第一代CAR，第三代CAR修饰的JurkatT细胞接触MUC1分子后，其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均显著优于第一代MUC1修饰细胞(MUC1-CAR)。 本课题研究结果表明:靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞，为应用MUC1-CAR修饰的患者原代T细胞用于肝癌过继性免疫细胞治疗的研究提供了可靠实验依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 嵌合抗原受体的概念及其应用

1．1．1 嵌合抗原受体的结构

1．1．3 嵌合抗原受体修饰的T细胞杀伤原理

1．1．3 嵌合抗原受体修饰的T细胞应用现状

1．2 MUC1作为免疫治疗靶点的研究

1．2．1 MUC1的结构

1．2．2 MUC1与肿瘤

1．2．3 靶向MUC1的免疫治疗

1．3 MUC1与肝癌

1．4 本课题的研究目的和研究内容

第二章 靶向MUC1嵌合抗原受体的重组慢病毒载体构建

2．1 实验器材

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验材料

2．1．3 实验试剂

2．1．4 引物合成

2．1．5 实验试剂的配制

2．2 载体构建

2．2．1 pLV180-MUC1-CAR-F2A-hrGFP质粒载体的构建

2．2．2 pLV180-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP质粒载体的构建

2．2．3 pLV180-hrGFP质粒载体的构建

2．2．4 质粒载体的大量提取

2．3 慢病毒的包装

2．3．1 辅助质粒QJ001和QJ005的大量抽提

2．3．2 293T细胞的复苏与培养

2．3．3 慢病毒的包装与浓缩

2．3．4 慢病毒的浓缩

2．4 实验结果

2．4．1 载体构建结果

2．4．2 慢病毒包装结果

2．5 讨论

第三章 MUC1特异性嵌合抗原受体对Jurkat细胞株的遗传修饰

3．1 实验器材和试剂

3．1．1 实验所需材料

3．1．2 实验所需仪器

3．1．3 实验所需主要试剂

3．1．4 主要试剂配置方法

3．2 细胞培养及传代

3．3 慢病毒感染Jurkat细胞株

3．4 Western blot检测G3MUC1-CAR和MUC1-CAR的表达

3．5 实验结果

3．5．1 慢病毒感染Jurkat细胞株实验结果

3．5．2 Western blot检测G3MUC1-CAR和MUC1-CAR的表达实验结果

3．6 讨论

第四章 MUC1特异性嵌合抗原受体修饰后的Jurkat细胞株的体外功能性实验

4．1 实验器材和试剂

4．1．1 实验所需材料

4．1．2 实验所需仪器

4．1．3 实验所需主要试剂

4．2 增殖实验

4．3 流式检测肝癌细胞MUC1表达

4．4 IL-2的检测

4．5 杀伤实验

4．6 实验结果

4．6．1 增殖实验结果

4．6．2 流式检测肝癌细胞表达MUC1

4．6．3 IL-2的检测结果

4．6．4 杀伤实验结果

4．7 讨论

全文小结

参考文献

综述：嵌合抗原受体发展中遇到的挑战

缩略词表

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢