甲磺酸去铁胺对“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预及部分机制的实验观察

摘要

第一部分甲磺酸去铁胺对小鼠“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预后骨量变化
　　目的：本研究旨在探讨铁螯合剂甲磺酸去铁胺（DFO）对去势后枸橼酸铁铵（FAC）干预的雌性小鼠（模拟“I型铁蓄积骨质疏松症小鼠模型”）骨量的影响，为“I型铁蓄积骨质疏松症”探索新的治疗方案。
　　方法:选取2月龄C57BL/6雌性小鼠24只，随机分为去势（OVX）组、去势+铁剂干预组（OVX+Fe组）、去势+铁剂+去铁胺组（OVX+Fe+DFO组）。三组均行双侧卵巢切除术，后两组在去势后一周采用0.12g/kg/w的枸橼酸铁铵干预6周，干预方法为腹腔注射，每周干预三次，OVX组采用同样方式和频次的生理盐水干预。随后OVX+Fe+DFO组采用4000mg/kg/w的DFO干预2周，干预方法为腹腔注射，一日两次，其他两组给予同样方式和频次的生理盐水干预。干预结束后处死小鼠，在处死小鼠的前10天及前3天给小鼠腹腔注射钙黄绿素。处死小鼠后分离双侧小鼠股骨，HE染色及微计算机断层扫描技术（Micro-CT）观察股骨远端微结构，钙黄绿素标记骨形成速率，普鲁士蓝染色观察股骨局部铁蓄积，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测骨组织骨保护素（OPG）、核因子κ B受体活化因子配体（RANKL）的表达，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测小鼠血清铁蛋白、OPG和RANKL水平。
　　结果:血清铁蛋白水平方面，OVX+Fe组（408.90±17.20μg/ml）明显高于 OVX组（87.53±3.73μg/ml）和OVX+Fe+DFO组（162.30±10.58μg/ml）（P<0.05）。普鲁士蓝染色显示股骨铁蓄积 OVX组　　结论：DFO对“I型铁蓄积骨质疏松症”小鼠模型的骨量有恢复作用，DFO的干预作用与成骨和破骨功能都有关联。
　　第二部分含铁环境中原代成骨细胞在甲磺酸去铁胺（DFO）干预后的生物活性变化及机制研究
　　目的：研究甲磺酸去铁胺(DFO)对于含铁环境原代成骨细胞（FAC干预）活性的影响，并探究其可能的机制。
　　方法：通过颅骨酶消化法从C57BL/6小鼠出生三天内胎鼠的颅盖骨分离原代成骨细胞（Osteoblast，OB），进行体外诱导分化培养、碱性磷酸酶染色鉴定后，传代培养至第三代。用CCK8法分别确定FAC及DFO的干预浓度后，分为3组:对照组，50uM/LFe（FAC）干预组，Fe+DFO组（50uM/LFe干预同时加入20uM/LDFO）。干预后三组细胞分别行碱性磷酸酶染色和活性定量，茜素红染色和结节计数，对相关基因（Runx2，Sp7，Bglap，Axin2，OPG，Sod1）进行定量PCR检测其mRNA的表达水平,DCFH荧光探针分析各组活性氧水平。将50uM/LFe（FAC）干预的原代成骨细胞，分为四组，分别用0，5，10，20 uM/LDFO干预后，行茜素红染色并计数，DCFH荧光探针分析各组活性氧水平，Westernblot检测 Axin2蛋白表达水平。再将原代成骨细胞分为4组，分别为对照组，50uM/LFe干预组，Fe+DFO组（50uM/LFe干预同时加入20uM/LDFO），Fe+DFO+DKK-1组（50uM/LFe干预同时加入20uM/LDFO+500ng/mlDKK-1），用DCFH荧光探针分析各组活性氧水平，Westernblot检测Axin2及OPG蛋白表达水平，用茜素红染色检测其矿化能力。
　　结果：CCK8结果显示，Fe50uM/L，DFO20uM/L干预，不影响细胞活性，各组之间没有统计学差异（P<0.05）。与对照组相比，Fe剂干预组，成骨相关基因Runx2，Sp7，Bglap，Axin2，OPG表达下降，而氧化应激相关指标Sod1表达上升，而Fe+DFO干预组与Fe干预组相比成骨相关基因表达上升，氧化应激指标下降，差异有统计学意义（P<0.05）。ALP染色及活性定量定量和茜素红染色及结节计数与对照组相比，Fe组下降，而Fe+DFO组比Fe组上升，差异有统计学意义（P<0.05）。DCFH荧光显示活性氧水平，Fe组明显高于对照组，Fe+DFO组低于 Fe组，差异有统计学意义（P<0.05）。对50uM/LFe（FAC）干预的原代成骨细胞分别行0，5，10，20uM/LDFO干预。茜素红染色及结节计数显示随着 DFO浓度增加，结节数量增加；Westernblot显示Axin2蛋白表达水平随着DFO浓度增加而增加；DCFH荧光显示随着DFO浓度上升，活性氧水平逐渐下降，差异有统计学差异（P<0.05）。使用DKK-1干预后，DCFH荧光显示 Fe+DFO+DKK-1组和 Fe+DFO组活性氧水平无统计学差异（P>0.05）；Westernblot显示OPG及Axin2蛋白表达水平Fe+DFO+DKK-1组低于Fe+DFO组；茜素红染色及钙结节计数显示Fe+DFO+DKK-1组少于Fe+DFO组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：在含铁环境中，原代成骨细胞成骨生物学活性抑制、骨相关基因的表达降低，原因可能与ROS增加、Wnt通路改变相关；DFO干预可有效抑制ROS增加，恢复原代成骨细胞相关指标。

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前言

一、I型铁蓄积骨质疏松症

二、甲磺酸去铁胺与“I型铁蓄积骨质疏松症”

三 甲磺酸去铁胺对“I 型铁蓄积骨质疏松症”作用的机制研究

四、甲磺酸去铁胺在“I型铁蓄积骨质疏松症”治疗中的意义

五、总结

参考文献

第一部分 甲磺酸去铁胺对小鼠“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预后骨量变化

1.实验试剂和仪器

2.实验方法

3.结 果

4.讨 论

5.参考文献

第二部分 含铁环境中原代成骨细胞在DFO干预后的生物活性变化及机制研究

1.实验试剂和仪器

2.实验方法

3.结 果

4.讨 论

5.参考文献

结论

综述: 甲磺酸去铁胺（ DFO）与骨代谢研究进展

英汉主要缩略词表

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