非培养自体表皮细胞悬液与鱼来源胶原膜复合移植修复大面积深度烧伤创面的实验研究

摘要

目的：
　　探索一种能够快速分离表皮及真皮的方法，从而制备高细胞数及细胞活性的细胞悬液，且拟以胶原膜为覆盖物或真皮替代物进行移植修复深度烧伤创面，为临床大面积深度烧伤创面的修复提供一种可供选择的新方法。
　　方法：
　　1.探索最佳分离条件、制备表皮细胞悬液
　　（1）酶一步消化法分离表皮及真皮，制备细胞悬液，流式上机测定细胞数及细胞活性，从而确定最佳消化条件；
　　（2）免疫组化P63染色验证人表皮、真皮分离的程度及基底层细胞存留情况。
　　2.自制胶原膜、检测物理及生物学特性
　　（1）以酸溶解鱼鳞，从而提取胶原，经真空冷冻干燥制备胶原膜；
　　（2）将制备的胶原膜行HE染色、Masson染色及扫描电镜观察以了解其组织结构特性；
　　（3） GB/T4472-2011法测定胶原膜密度；
　　（4） CCK-8法测定胶原膜细胞毒性。
　　3.裸鼠表皮细胞移植实验
　　（1）制备人表皮细胞悬液，以裸鼠为实验对象制备深度烧伤创面，以胶原膜为覆盖物，进行表皮细胞悬液移植；
　　（2）观察创面愈合情况，计算创面愈合率；
　　（3）取移植后标本，行HE染色观察细胞浸润情况，行Masson染色观察胶原排列情况，行免疫组化HLA-ClassⅠ染色，验证人来源细胞是否参与了上皮化过程。
　　结果：
　　1.制备的表皮细胞悬液中细胞数及细胞活性受消化酶浓度及消化时间的共同影响，在使用0.25％DispaseⅡ-0.25%Trypsin消化20min的条件下，细胞数及细胞活性最高；在消化相同时间条件下，随着消化液浓度增高，细胞数及细胞活性均先增高后降低；在相同的消化浓度下，随着消化时间延长，细胞数及细胞活性均先增高后降低。免疫组化P63染色，分离前基底层细胞染色呈阳性，分离后表皮无真皮成分，基底层染色阳性，分离后真皮无表皮成分，且无阳性染色。
　　2.制备的鱼来源胶原膜表面平整、光滑，随形性较好，柔韧性好，富有弹性，厚度约0.3mm，其密度为（42.76±0.13）kg/m3。HE染色及 Masson三色染色均可见粗细不等的胶原走行、排列有序，胶原之间错综复杂，形成大小不等的网孔状结构。扫描电镜可见胶原纤维呈网状排列，孔隙大小100um~200um之间。细胞毒性实验见第1~7天实验组与对照组细胞相对增殖率随时间延长而增高，同一天两组间细胞相对增殖率无明显差异（P>0.05）。
　　3.移植后2周，各组未见胶原膜残留，部分创面可见皮岛形成，至移植后4周，复合移植组创面大部分已完全愈合，创面愈合率可达90%以上，表皮细胞悬液组创面部分愈合，创面愈合率小于复合移植组，胶原膜组及空白对照组仅创缘少许上皮化，残余创面较多。复合移植组新生皮肤基底层免疫组化染色为阳性，人来源细胞参与了上皮化过程。HE染色可见炎性细胞浸润、新生血管形成，其余各组细胞浸润及血管形成较少；Masson染色各组胶原走行、排列有序。
　　结论：
　　1.在25℃条件下，采用0.25%DispaseⅡ-0.25% Trypsin消化大腿刃厚皮（厚度为0.3~0.4mm、面积为1cm×1cm大小）20min，所制备的细胞悬液中单位体积悬液所含的细胞数最多、细胞活性最高。
　　2.鱼来源胶原膜外观平整、光滑，厚度仅0.3mm左右，胶原纤维呈网孔状，孔隙约200um~300um，安全无毒，可作为自体表皮细胞悬液移植的覆盖物。
　　3.胶原膜与表皮细胞悬液复合移植是一种修复深度烧伤创面的良好手段，其修复创面的机制可能为皮岛形成，有望成为修复大面积深度烧伤创面的可供选择的方法之一。

目录

声明

引言

第一部分 探索最佳分离条件、制备表皮细胞悬液

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 自制胶原膜、检测物理及生物学特性

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

第三部分 裸鼠表皮细胞悬液移植实验

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:微型皮片移植现状及展望

附录

在读期间论文发表及获奖情况

致谢