钛表面含硅二氧化钛纳米管层促进成骨的体内研究

摘要

第一部分钛表面含硅二氧化钛纳米管层的制备及表征
　　目的：利用阳极氧化法技术在钛表面制备二氧化钛纳米管层，采用等离子体浸没离子植入和沉积法将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面，制备含硅二氧化钛纳米管层，并检测其表征。方法：将钛片置于溶液中使用阳极氧化法制备二氧化钛纳米管层，采用等离子体浸没离子植入和沉积法将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面，将该涂层与二氧化钛纳米管涂层进行对照研究。扫描电镜观察两种涂层的形貌，XPS测定两组涂层的元素组成，自动化接触角测量仪测量两组涂层表面的水接触角。结果：XPS显示，含硅二氧化钛纳米管层中含有0.51wt％的硅元素；两种涂层含有相同的钛、氧及碳元素，硅基质峰清晰显示；扫描电镜结果显示硅元素的加入没有改变涂层的表面形貌。含硅二氧化钛纳米管涂层和二氧化钛纳米管涂层的水接触角分别为11.25±0.88°，35.89±1.38°，说明含硅二氧化钛纳米管涂层的亲水性改善。结论：采用等离子体浸没离子植入和沉积法将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面未明显改变二氧化钛纳米管涂层的表面形貌，增加了涂层的亲水性。
　　第二部分钛表面含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞活性的影响
　　目的：研究钛表面含硅纳米管层对成骨细胞MC3T3-E1细胞粘附活性的影响。方法：以含硅二氧化钛纳米管层作为实验组，二氧化钛纳米管层及光滑钛片作为对照组，在三组涂层表面分别种植MC3T3-E1细胞。采用MTS法分别在1d、3d和5d检测粘附于涂层表面的细胞数目；培养12小时，进行细胞肌动蛋白张力纤维、细胞核两重荧光染色，观察两组涂层表面细胞局部粘着斑及细胞骨架的分布形态。扫描电镜于1d、3d和5d观察成骨细胞在两组材料表面的铺展情况；结果： MC3T3-E1细胞在三组涂层表面培养，在培养的第1天和3天，MTS检测结果显示粘附于含硅二氧化钛纳米管层（Si-TiO2-NTs）表面及二氧化钛纳米管层（TiO2-NTs）表面的细胞数量比光滑钛（Ti）表面的细胞数量显著增多。在第5天培养时，Si-TiO2-NTs上的细胞增殖显著高于对TiO2-NTs上的细胞增殖(p<0.05)；在共同培养12h时，二氧化钛纳米管层和含硅二氧化钛纳米管层表面表现出更好的细胞铺展情况。说明纳米管层更有利于细胞附着。电镜观察涂层表面细胞形态培养1天时， MC3T3-E1细胞在Si-TiO2-NTs表面伪足生长较TiO2-NTs表面好。培养3天可见含硅二氧化钛纳米管层组丝状伪足活性增加，并可见细胞合并。培养5天可见细胞覆盖钛片表面含硅二氧化钛纳米管层组有更多的丝状伪足连接。结论：在含硅纳米管层组表面培养的MC3T3-E1细胞数量和纳米管层表面组在前三天没有明显区别，但两组均明显多于光滑钛片组。第5天开始含硅纳米管层组细胞数量较纳米管层组增多。含硅纳米管层组细胞分化较纳米管层组细胞明显增强，说明含硅二氧化钛纳米管层可以有效促进成骨细胞MC3T3-E1细胞的粘附及分化。
　　第三部分钛表面含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞矿化、成骨基因的影响
　　目的：研究含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞MC3T3-E1矿化及成骨的影响。方法：以含硅二氧化钛纳米管层作为实验组，单纯二氧化钛纳米管层作为阳性对照组，光滑钛片表面作为阴性对照组，以相同的密度在三组涂层表面分别种植MC3T3-E1细胞。于1周收集标本，采用实时定量 RT-PCR法检测三组钛片表面MC3T3-E1细胞Col-I、ALP、Runx2、OCN、OPN表达。相同方法培养细胞，于第1、2、3周用Western blot法检测MC3T3-E1细胞Runx2, ALP and Col-I蛋白在三组材料表面的表达。将MC3T3-E1细胞在三组材料表面成骨诱导培养4周，检测第3、4周材料表面细胞外基质矿化水平。结果：实时定量RT-PCR检测结果显示1周时含硅二氧化钛纳米管层组中各个基因表达均高于对照组（p<0.01）。Western blot法检测显示在第1周和第3周，在含硅二氧化钛纳米管层组上观察到 Runx2的表达增强，第1周时，在含硅二氧化钛纳米管层组上的ALP表达水平比二氧化钛纳米管层显著增加。Col-1的表达在三组材料之间没有明显差异。第3周和4周含硅二氧化钛纳米管层组和二氧化钛纳米管层组上的细胞与光滑钛片组相比显示升高的钙矿物结节形成（p<0.05）。第4周含硅二氧化钛纳米管层组上沉积的钙矿物比其他两组显著增加（p<0.05）。结论：与二氧化钛纳米管层组相比，含硅二氧化钛纳米管层组可以上调成骨基因的表达和 Runx2、ALP蛋白表达促进 MC3T3-E1细胞成骨分化，并可以增加成骨细胞外基质矿化水平，表明含硅二氧化钛纳米管层是一种成骨活性良好的涂层材料。
　　第四部分钛表面含硅二氧化钛纳米管层在SD大鼠体内的成骨研究
　　目的：研究钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层在SD大鼠体内成骨表现。方法：以含硅二氧化钛纳米管层钛螺钉作为实验组，单纯二氧化钛纳米管层钛螺钉作为阳性对照组，普通钛螺钉表面作为阴性对照组，将三组螺钉置入 SD大鼠股骨内，饲养六周后处死。在第2、4和6周分别测定三组螺钉的拔出力。在第6周用Micro-CT和免疫组化方法测定螺钉周围成骨情况。结果：三组螺钉拔出力学结果显示，第2、4周含硅二氧化钛纳米管层组比二氧化钛纳米管层组增加18%、21%，并于其他两组相比有统计学意义（p<0.05）。拔出力在第6周三组螺钉之间没有差别。第6周Micro-CT扫描及免疫染色结果显示含硅二氧化钛纳米管层螺钉周围比对照有更多的新生骨形成。定量检测显示含硅二氧化钛纳米管层组和二氧化钛纳米管层组与普通钛螺钉组相比，骨结合率（％OI）增加约65％和54％，骨体积比（BV/TV）约4.2倍和2.4倍，平均小梁厚度（Tb.Th）约88％和86％，平均小梁数（Tb.N）分别为约1.3倍和12％，以及平均小梁间隔（Tb.Sp）分别减少约65％和54％（p<0.05）。含硅二氧化钛纳米管层组和二氧化钛纳米管层组相比在BV/TV、Tb.N和Tb.Sp有区别（p<0.05）。结论：钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层在大鼠体内可明显促进新生骨的形成和增加螺钉的拔出力。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 钛基关节假体含硅二氧化钛纳米管层涂层的制备及表征

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞活性的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 钛表面含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞矿化、成骨基因的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 钛表面含硅二氧化钛纳米管层在SD大鼠体内的成骨研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

综述:钛金属表面TiO2纳米管层的成骨研究进展

缩略词表

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