G蛋白抑制性α亚单位蛋白介导胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)信号转导机制研究

摘要

目的：旨在明确G蛋白抑制性α亚单位蛋白（Gαi蛋白）及Gab1介导胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）信号转导的作用及相关分子机制。
　　方法：培养野生型（WT）和Gαi1/3双敲除型（DKO）小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs），Gαi1或者Gαi3单敲除（SKO）的小鼠成纤维细胞（MEFs），Gαi2单敲除的MEFs；
　　运用shRNA在MEFs中靶向敲减Gαi1和/或Gαi3；
　　在Gαi1/3双敲除型（DKO）MEF重新导入Gαi1或者Gαi3表达质粒，恢复Gαi1或Gαi3表达；运用Gab1敲除的细胞；
　　构建稳定表达野生型Gαi1/3的MEFs；
　　构建稳定表达显性负性遗传Gαi1/3的MEFs；
　　上述细胞中给予不同浓度的GDNF刺激后，用WB、免疫共沉淀等方法检测：GDNF受体、Gab1、Gαi的表达/耦联情况，及下游信号PI3K-Akt-mTOR、Erk-MAPK等活化情况。
　　结果：
　　Gαi1/3双敲除型（DKO）阻断GDNF诱导的AKT-mTOR/ERK-MAPK信号通路的活化；
　　MEFs中，Gαi1-KO、Gαi3-KO、Gαi1-shRNA、Gαi3-shRNA抑制GDNF诱导的下游信号活化水平部分降低；
　　DKO MEF中重新导入Gαi1或Gαi3后，GDNF信号部分恢复；
　　外源性过表达野生型Gαi3易化GDNF诱导的下游信号的转导；
　　Gαi1/3显性负性遗传抑制GDNF诱导的下游信号的转导；
　　GDNF可诱导GFR-Gαi-Gab1的复合物的形成；
　　MEFs中Gab1敲除阻断GDNF诱导的AKT-mTOR/ERK-MAPK信号通路的活化。
　　结论：Gαi-Gab1信号复合物作为GDNF-GFR的重要接头蛋白，介导下游多条重要信号的转导。

目录

声明

前言

材料与方法

实验细胞

实验耗材

实验主要仪器

实验主要试剂与药品

实验主要抗体

主要试剂配制

MEFs培养

蛋白质免疫印迹分析（Western Blot）法

构建Gαi1/3 shRNA稳转细胞株

免疫共沉淀方法

统计学方法

结果与分析

1. MEF中，Gαi1和Gαi3双敲除阻断GDNF介导的下游AKT-mTOR、ERK-MAPK信号通路的活化。

2. MEF中，Gαi1和Gαi3双敲除不影响上游Ret1和GFRα1的表达和活化。

3. MEF中，Gαi1和Gαi3双敲除阻断其他GDNF家族（NRTF、ARTN）下游信号通路的转导。

4. MEF中，单敲Gαi1或Gαi3部分抑制GDNF诱导的下游信号的活化；而敲除Gαi2对GDNF诱导的下游信号无显著影响。

5. MEF中，shRNA敲减Gαi1/3抑制GDNF诱导的AKT-mTOR及ERK1/2的活化。

6. 在Gαi1和Gαi3双敲除的MEFs外源性导入Gαi1或者Gαi3部分拯救GDNF诱导的AKT-mTOR/ERK-MAPK信号通路的活化。

7. 外源性过表达野生型Gαi3易化GDNF诱导的下游信号的转导。

8. Gαi1/3显性负性遗传抑制GDNF诱导的下游信号的转导。

9. GDNF诱导Ret1-Gαi-Gab1复合物耦联。

10. GDNF信号通路中，Gab1是Gαi的下游通路蛋白。

11. Gab1敲除阻断GDNF诱导的下游信号的转导。

12. 小鼠海马神经元中，shRNA 敲减 Gαi1/3 抑制 GDNF 诱导的AKT-mTOR及ERK1/2的活化。

讨论

结论

参考文献

综述:神经营养因子研究的相关进展

中英文缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢