醛固酮诱导血管内皮细胞自噬的机制以及自噬在醛固酮诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用

摘要

目的：研究醛固酮（ Aldosterone,Ald）诱导人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC）自噬的机制，以及自噬在醛固酮诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用。
　　方法：以不同浓度的Ald及不同时间对HUVEC进行刺激，用western blot方法检测自噬相关蛋白Microtubule-associated protein1 light chain3（MAP1-LC3,LC3）、Beclin-1、Sequestosome-1（SQSTM1/p62）表达量的变化，确定最佳处理时间和最佳处理浓度；并用此浓度及时间观察了Ald对细胞活力的影响[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT法]。然后，分别用Ald受体拮抗剂依普利酮（Eplerenone）、线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂（5-hydroxydecanoate,5-HD）、抗氧化剂（Tempol）、自噬抑制剂（3-methyladenine,3-MA）及自噬促进剂（Rapamycin）预处理细胞，用western blot方法检测Ald诱导的自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、SQSTM1/p62表达量的变化。用试剂盒检测各组中Nitric Oxide（NO）含量的变化。用实时定量荧光聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR,Q-PCR）和酶联免疫吸附测定试剂盒（enzyme linked immunosorbent assay kit,Elisa kit）检测各组中内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、白介素-10（interleukin-10,IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）表达量。用免疫共沉淀检测与盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor,MR）可能存在结合的自噬相关蛋白。用免疫荧光共定位验证Beclin-1与MR存在相互作用。检测细胞高表达Beclin-1后对Ald诱导的细胞因子表达量的变化。
　　结果：Western blot结果显示Ald处理血管内皮细胞后，LC3-II/LC3-I、Beclin-1表达量增多，SQSTM1/p62表达量降低，并且具有浓度依赖性和时间依赖性，表明Ald可诱导HUVEC自噬，最佳时间及浓度分别为48小时和100nM，细胞用此浓度Ald刺激48小时其活力无显著变化；依普利酮和抗氧化剂对Ald诱导的自噬水平起抑制作用；线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-HD对Ald诱导的细胞自噬没有影响；3-MA和Rapamycin分别对Ald诱导的自噬水平起到抑制和加强作用；Ald降低了内皮细胞中NO表达量；3-MA和Rapamycin对于Ald处理的内皮细胞中NO含量下降没有影响；Ald增强了内皮细胞中IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β表达量，但对ET-1和TNF-α的表达量没有影响；3-MA对Ald诱导的内皮细胞中IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β表达量的增高和ET-1没有影响；但是，Rapamycin显著抑制了Ald诱导的内皮细胞中IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β表达量的增高，但对ET-1没有影响；MR与Beclin-1存在相互结合；Beclin-1高表达后，降低Ald诱导的内皮细胞中IL-6、IL-8、TGF-β表达量的增高，对IL-10没有影响。
　　结论：Ald能诱导人脐静脉内皮细胞自噬，其机制可能是Ald通过与盐皮质激素受体受体（MR）结合后诱导细胞内活性氧增加，从而引起内皮细胞自噬的发生。自噬在Ald诱导的内皮细胞功能损伤中与NO含量下降没有关系。但是，激活的自噬可通过Beclin-1与MR结合，降低Ald诱导的炎症因子IL-6、IL-8、TGF-β的增高，从而一定程度地抑制Ald诱导的内皮细胞的炎症反应。

目录

声明

引言

实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、醛固酮作用不同时间点对血管内皮细胞自噬的影响

二、不同浓度的醛固酮对血管内皮细胞自噬的影响

三、醛固酮刺激48小时对血管内皮细胞生存率（活力）的影响

四、依普利酮在醛固酮诱导血管内皮细胞自噬中的作用

五、线粒体ATP敏感性钾通道在醛固酮诱导血管内皮细胞自噬中的作用

六、抗氧化剂Tempol在醛固酮诱导血管内皮细胞自噬中的作用

七、自噬抑制剂3-MA对醛固酮诱导血管内皮细胞自噬的影响

八、自噬促进剂雷帕霉素对醛固酮诱导血管内皮细胞自噬的影响

九、自噬对Ald诱导后内皮细胞NO含量的影响

十、自噬对Ald诱导后内皮细胞细胞因子的影响

十一、自噬对Ald诱导后内皮细胞炎症因子的作用机制

讨论

结论和展望

结论：

展望：

参考文献

综述:自噬在血管平滑肌细胞中的作用

缩略词表

致谢