TREM-1在IL-1β介导的骨关节炎发病机理中的研究

摘要

背景：
　　骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种最常见的关节退行性疾病，是成人个体疼痛和残疾的主要原因。骨关节炎更是对中老年人群的生活质量产生严重的影响，是老年人致残的重要因素。随着我国老龄化人口的快速增长，骨关节炎对家庭和全社会的影响和负担日益突出。骨关节炎的病因包括关节损伤、肥胖、衰老和遗传等多种因素。然而，骨关节炎的发生和发展的详细分子机制尚不清楚。目前，没有有效措施可用于恢复退化的软骨或减缓疾病的进展。
　　髓系细胞触发受体-1（TREM-1）是一种新的细胞表面受体，免疫球蛋白超家族的成员之一，通过促进分泌的促炎介质有效力地放大炎症反应。有报道显示TREM-1在发炎的滑膜中较正常中表达上调。然而，在骨关节炎中 TREM-1的具体功能以及作用机制还尚不清楚。
　　目的：
　　1.验证TREM-1在人正常关节软骨组织和骨关节炎软骨组织中的差异表达。
　　2.明确TREM-1表达有效抑制后对TNF-α、MMP-13和II型胶原在IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞中表达的影响。
　　3.明确TREM-1表达有效抑制后对体外原代培养的IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。
　　4.观察TREM-1表达有效抑制后对NF-κB通路关键因子在IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞中表达的影响；探讨 TREM-1对骨关节炎软骨细胞 TNF-α、MMP-13和II型胶原表达以及增殖和凋亡影响的作用机制。
　　5.验证TREM-1表达有效抑制后对MMP-13、II型胶原和NF-κB通路关键因子在小鼠骨关节炎模型中表达的影响。初步阐释 TREM-1在骨关节炎发生发展中起到的作用，为骨关节炎分子靶向治疗提供潜在的靶点和理论依据。
　　方法：
　　1.采用qRT-PCR和Western blot方法检测TREM-1在人骨关节炎软骨组织与正常骨关节软骨组织中的表达情况。
　　2.采用酶两步消化法获取并原代培养正常人膝关节软骨细胞，细胞单层爬片后采用甲苯胺蓝染色法、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色加以鉴定。
　　3.针对 TREM-1基因设计 shRNA序列，构建相应的表达载体并进行慢病毒包装。利用Lipofectamine2000转染试剂慢病毒介导的shTREM-1载体转染进细胞中。采用qRT-PCR和Western blot检测TREM-1在转染shTREM-1和对照的软骨细胞中的表达。
　　4.转染shTREM-1后，采用qRT-PCR、ELISA和Western blot检测TREM-1对TNF-α、MMP-13和II型胶原在IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞中表达的影响。
　　5.转染shTREM-1后，MTT比色法检测TREM-1对IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞增殖的影响。
　　6.转染shTREM-1后，流式细胞术检测TREM-1对IL-1β诱导的正常人关节软骨细胞凋亡的影响。
　　7.采用Western blot检测NF-κB通路关键因子IκBα和 p65的表达。
　　8.采用免疫荧光染色法检测NF-κB通路关键因子NF-κB p65在细胞质和细胞核中的定位。
　　9.我们通过切断雄性C57BL/6小鼠的膝关节前交叉韧带（ACLT）和外侧半月板切除，成功的制作小鼠膝关节骨性关节炎模型（OA组）。一半术后的雄性小鼠接受膝关节腔注射慢病毒载体介导的shRNA（OA+shTREM-1组）。对照组为假手术对照组（NC组）。
　　结果：
　　1. TREM-1 mRNA和蛋白的表达水平在人骨关节炎软骨组织中与正常的骨关节软骨组织相比明显升高（P<0.05）。
　　2.采用酶两步消化法获得了人膝关节软骨细胞，经甲苯胺蓝染色法、II型胶原免疫细胞化学染色鉴定后，其纯度及生物学活性符合后续实验要求。并且成功将慢病毒介导shTREM-1转染至体外培养的软骨细胞中。TREM-1 mRNA和蛋白的表达水平在转染shTREM-1的软骨细胞中与对照组相比显著下降（P<0.05）。
　　3. IL-1β诱导软骨细胞后， TNF-α和MMP-13较无IL-1β诱导软骨细胞中的表达明显升高，而II型胶原的表达则是明显下降（P<0.05）；同时显著降低细胞增殖能力和促进了细胞凋亡（P<0.05）。转染shTREM-1后显著抑制这种效果（P<0.05）。
　　4.在软骨细胞中，IL-1β通过促进p65表达和降低IκBα表达来激活NF-κB信号通路；免疫荧光染色法显示IL-1β诱导NF-κB p65从细胞质转移细胞核；IL-1β同时降低细胞增殖能力和诱导细胞凋亡。这种作用被NF-κB的抑制剂PDTC和shTREM-1所抑制（P<0.05）。
　　5.与对照组比较， TREM-1在骨关节炎模型中的表达显著上调，但转染shTREM-1后的骨关节炎模型中的表达有所下调（P<0.05）。MMP-13和p65的表达在骨关节炎模型中也明显上调，而Type II collagen和IκBα表达则显著降低，转染shTREM-1后明显抑制这种作用。
　　结论：
　　1. TREM-1在骨关节炎软骨组织中均高表达，可能与骨关节炎的发生发展密切相关。
　　2.采用酶两步消化法可成功获得原代正常人膝关节软骨细胞，经鉴定后细胞纯度与所具有的功能表型可用于后续细胞学实验。慢病毒介导TREM-1 shRNA可高效地转染进体外培养的关节软骨细胞，可显著降低细胞内TREM-1的表达量。
　　3. TREM-1表达有效抑制后可通过抑制TNF-α和MMP-13的表达，促进软骨细胞中 II型胶原的合成和软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡。有利于软骨基质的完整和生物学功能的稳定，延缓骨关节炎的发病，提示 TREM-1在骨关节炎的发病过程中扮演了重要的角色。
　　4.在软骨细胞中，IL-1β通过促进p65表达和降低IκBα表达来激活NF-κB信号通路，并且IL-1β能够降低细胞增殖能力和诱导细胞凋亡，这种作用被NF-κB的抑制剂PDTC和shTREM-1所抑制。所有结果提示shTREM-1可能通过抑制NF-κB信号通路来延缓骨关节炎的发展。
　　5. MMP-13和p65的表达在骨关节炎模型中明显上调，而Type II collagen和IκBα表达则显著降低，转染shTREM-1后明显抑制这种作用，提示shTREM-1可能通过抑制NF-κB信号通路来延缓骨关节炎的发展。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 TREM-1 在人关节软骨组织的表达

一、前 言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

第二部分 人软骨细胞分离培养及鉴定

一、前 言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

第三部分 分析软骨细胞在IL-1β诱导下， TREM-1对TNF-α、type II collagen、MMP-l3 表达、软骨细胞增殖、凋亡的影响以及作用机制研究

一、前 言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

第四部分 TREM-1在小鼠骨关节炎模型软骨中的表达及对Type II collegan、MMP-13及NF-κB信号通路的影响

一、前 言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

结论

综述:骨关节炎发病机制的研究进展

英文缩略语注释表

攻读博士学位期间发表的论文

致谢