反相色谱法在中性样品和离子化样品测试中的应用

摘要

高效液相色谱法是分离和分析化学混合物的各种色谱法中的一种，历经数十年的不断改进，在理论和实践方面日趋完善。自《中国药典》收录了高效液相色谱法之后，该方法应用于药品检测的比例迅速增长，已经成为主流的分析检验手段，而其中最为广泛使用的是反相色谱法(RP-HPLC)。本论文针对目前《中国药典(2015版)》没有收录的两个原料药品种利伐沙班和恩替卡韦，考察不同化学性质的样品在RP-HPLC分析方法中的区别，从而更好地指导工业化生产中质量控制方法的开发研究，也更有效的建立实用的测试方法。
　　本文第一部分为“利伐沙班(中性样品)中控方法开发”。原料药利伐沙班是由拜耳公司(德国)研发的一种抗凝药，这种抗凝药是对 Xa因子具有生物活性的选择性抑制剂。本实验采用了RP-HPLC法，使用C18色谱柱，利用样品为不带正电荷和负电荷的中性样品，针对起始原料及工艺中产生特有的三个杂质及利伐沙班含量，进行检验方法的开发考察，以求在制备过程中能够快速、准确监控产品性质。结果：对利伐沙班含量及三个杂质的测定方法专属性好，主成分峰在0.054-2.718?g/ml的线性范围，3-吗啉酮在0.053-2.670μg/ml范围内、杂质Ⅰ在0.051-2.548μg/ml范围内、杂质Ⅱ在0.051-2.571μg/ml范围内的相关系数均大于0.999，线性关系良好，并确定了三个杂质对利伐沙班的响应因子。定量限和检测限、精密度和准确度均达到满意的要求，该方法的分离度好，耐用性强，方法简单易操作，达到了作为中控方法的预期要求。
　　本文另一部分研究内容为“恩替卡韦(离子化样品)主成分和杂质含量测定的方法学研究”。原料药恩替卡韦是由美国百时美-施贵宝公司针对乙型肝炎(HBV)研制开发的抗病毒新药，在动物试验和临床研究中均显示出强大的抗HBV功效。目前该药已成为慢性乙型肝炎治疗的一线用药，并显示出良好的安全性。在方法开发过程中，通过研究缓冲液的浓度、紫外检测波长、梯度的不同比例以及不同柱温等参数，从理论塔板数、分离度、拖尾因子以及容量因子等指标进行评估，寻找合适的测试条件。最终，采用 RP-HPLC法以梯度淋洗的方式测定恩替卡韦含量以及非对映异构体ET-d1、ET-d2和ET-d3、以及相关杂质A、B和C的含量。该方法选用C18色谱柱，以含0.3ml三氟乙酸的水为流动相A，以乙腈为流动相B，设定254nm为检测波长，25度为柱温。恩替卡韦在0.061-0.61μg/ml溶液浓度范围内，ET-d1在0.063-0.627μg/ml溶液浓度范围内，ET-d2在0.058-0.582μg/ml溶液浓度范围内，ET-d3在0.060-0.597μg/ml溶液浓度范围内，杂质 A在0.061-0.606μg/ml溶液浓度范围内，杂质 B在0.061-0.606μg/ml溶液浓度范围内，杂质C在0.060-0.603μg/ml溶液浓度范围内，色谱峰响应值与峰面积均具有良好的线性关系，相关系数r均大约0.9999，平均回收率分别为98.3％、95.3%、96.8%、94.6%、100.7%、101.0%和99.1%，RSD%均小于2%(n=6)。方法的专属性良好、重复性高、准确度可靠，为系统地建立其质量控制体系提供支持。

目录

声明

第一章 绪论

1.利伐沙班的应用及质量控制现状

2.恩替卡韦的应用及现状

2.1恩替卡韦介绍

2.2抗病毒机制

2.3耐药分析和不良反应

2.4国内的应用

2.5恩替卡韦质量控制现状及方法开发的必要性

3.原料药质量控制方法-高效液相色谱法

3.1高效液相色谱法的分类

3.2高效液相色谱法在药品检验中的应用

4.本文研究内容及目标

第二章 利伐沙班中控方法开发

1.实验

1.1仪器与试剂

1.2实验测定方法

1.3溶液配制

2.结果与讨论

2.1检测波长选择

2.2专属性

2.3线性范围

2.4定量限(LOQ)和检测限(LOD)

2.5精密度

2.6准确度

2.7耐用性

2.8样品测定

3.结论

第三章 恩替卡韦及其杂质的方法学研究

1.生产工艺与杂质

1.1工艺杂质

1.2异构体

2.实验

2.1仪器与试剂

2.2测定方法

2.3溶液配制

3.结果与讨论

3.1方法参数选择

3.2系统适用性

3.3专属性

3.4强降解实验

3.5线性范围

3.6定量限与最低检测限

3.7准确度/回收率

3.8精密度

3.9中间精密度

3.10耐用性

3.11样品溶液稳定性

4.结论

全文小结

参考文献

攻读学位期间发表的文章

附录

致谢